زرقاء هلام بولي أكريلاميد الأصلية الكهربائي (BN - PAGE) للتحليل من المجمعات Multiprotein Lysates الخليوي

الهدف العام من التجربة التالية هو توصيف مركب MultiPro من المحللات الخلوية باستخدام الرحلان الكهربائي لجل بولي أكريلاميد الأصلي الأزرق ، والذي على عكس صفحة SDS ، يسمح بفصل البروتين في ظل الظروف الأصلية ويحافظ على تفاعلات البروتين. يتم تحقيق ذلك عن طريق غسيل الكلى المحلل الخلوي لإزالة الأملاح الزائدة مما يجعل العينة قابلة للفصل عن طريق الصفحة الأصلية الزرقاء كخطوة ثانية. يتم تطبيق المحللة على الصفحة الأصلية الزرقاء ذات البعد الأول ، والتي تفصل مجمعات البروتين في ظل الظروف الأصلية وفقا لحجمها وشكلها.

بعد ذلك ، بعد ثان. يتم إجراء تغيير طبيعة صفحة SDS من أجل تقسيم المجمعات إلى مكوناتها الفردية. يمكن تصور البروتينات عن طريق تلطيخ الفضة أو الكوماسي أو النشاف الغربي.

هنا تم الكشف عن البروتينات المنفصلة بواسطة صبغة الفضة في العرض التوضيحي التالي ، ومع ذلك ، سيتم استخدام النشاف الغربي. مرحبا ، أنا بريتا بلوم من مختبر وولفغانغ شارميل في قسم المناعة الجزيئية في معهد ماكس بلانك لعلم الأحياء المناعي في فريبيرج بألمانيا. مرحبا ، أنا دينا فيالا.

أنا أيضا من مختبر الشام. سنعرض لك اليوم إجراء لتحليل مجمعات MultiPro من المحللات الخلوية. نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة تكوين مستقبلات غشاء الوحدات الفرعية المتعددة.

ومع ذلك ، في هذا الفيديو نستخدم التشنج اللاإرادي البروتيازمي كمثال. لذلك دعونا نبدأ. دعونا قبل بدء هذا الإجراء ، قم بإعداد جميع المخازن المؤقتة كما هو موضح في البروتوكول المكتوب واحتفظ بها عند أربع درجات مئوية.

حصاد 10 ملايين HEC 2 9 3 خلية وحبيبها بالطرد المركزي عند 350 مرة G لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. ثم اغسل كريات الخلية بملليلتر واحد من PBS المثلج واستخدم الطرد المركزي لحبيبات الخلايا المغسولة. كرر هذا الغسيل مرتين ، ثم أعد تعليق حبيبات الخلية المغسولة في 250 ميكرولتر من الثلج.

أزرق بارد ، تحلل أصلي ، عازلة ، واحتضان التعليق على الجليد لمدة 15 دقيقة. بعد الحضانة ، قم بالطرد المركزي لخلايا الحياة عند 13،000 مرة G لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية لإزالة المواد غير القابلة للذوبان. في هذه الأثناء ، قم بإذابة ثقب في غطاء أنبوب الطرد المركزي الصغير سعة 1.5 مل باستخدام الجانب الساخن ذو القطر الكبير لماصة المعكرونة.

ثم ضع الأنبوب على الجليد ليبرد إلى أربع درجات مئوية. بمجرد اكتمال الطرد المركزي ، انقل المحللة إلى الأنبوب لإزالة الملح عن طريق غسيل الكلى. ضع غشاء غسيل الكلى المقطوع 10 كيلوڈالتون أعلى الأنبوب المفتوح.

أغلق الغطاء وقم بإزالة أي غشاء غسيل كلوي زائد بارز. ثم أغلق جانب الغطاء بعناية باستخدام البارام بمجرد إغلاقه ، واقلب الأنبوب وضعه رأسا على عقب في أنبوب مخروطي سعة 50 مل. الطرد المركزي للعينة بأقل سرعة ممكنة لمدة 10 ثوان.

في جهاز الطرد المركزي لزراعة الخلايا ، قم بإعداد دورق سعة 100 مل مع عازلة غسيل الكلى الأصلية الزرقاء الباردة وتقليب مغناطيسي باستخدام ما لا يقل عن 10 مل من محلول غسيل الكلى الأزرق الأصلي لكل 100 ميكرولتر من العينة. ثم قم بإزالة الأنبوب المقلوب من الأنبوب المخروطي باستخدام الملقط. لتجنب قلب الأنبوب على الجانب الأيمن لأعلى.

قم بربط الأنبوب بشريط رأسي على عقب داخل الدورق وقم بإزالة أي فقاعات هواء من الفتحة الموجودة أسفل الغطاء. باستخدام ماصة مثنية ، قم بتشغيل التقليب المغناطيسي واترك العينة لمدة ست ساعات أو طوال الليل في الغرفة الباردة لغسيل الكلى. افحص العينة من حين لآخر للتأكد من أن التقليب لا يخلق فقاعات هواء في غشاء غسيل الكلى.

بعد الحضانة ، انقل محللة خلية الغسيل إلى أنبوب طرد مركزي دقيق مبرد جديد واتركه على الجليد حتى تحميل تدرج الجل. يتم صب الجل في درجة حرارة الغرفة باستخدام خلاط متدرج. ضع الخلاط المتدرج على طبق تقليب وقم بتثبيته بقطعة من الأنابيب المرنة.

أغلق قناة الخلاط المتدرج باستخدام الصمام وأغلق الأنبوب بمشبك. ضع تقليب مغناطيسي في الأسطوانة المتصلة بالأنبوب. بعد ذلك ، قم بربط الأنبوب المرن في مضخة تمعجية وقم بإرفاق إبرة حقنة بنهايتها.

ثم ضع الإبرة بين اللوحين الزجاجيين في الجزء العلوي من جهاز الجل. قم بإعداد محاليل هلام منفصلة بنسبة 4٪ و 15٪ بحيث تكون الأحجام المجمعة مساوية للحجم الموجود في الجل الفاصل. أضف PS و TM لي مباشرة قبل.

استخدم واسكب محاليل الجل في الأسطوانات المقابلة للخلاط المتدرج. ثم قم بتشغيل الصمام وافتحه. اضغط فوق الأسطوانة اليسرى لإخراج فقاعة الهواء داخل القناة التي تربط خزاني الهلام.

قم بتشغيل المضخة بسرعة خمسة ملليلتر في الدقيقة. قم بإزالة المشبك واترك الجل يتدفق ببطء بين الألواح الزجاجية. ارفع الإبرة ببطء مع توقف الجل مؤقتا ، مع التأكد من أن الإبرة دائما فوق السائل.

اسمح لكل السائل بالدخول إلى جهاز الجل. ثم قم بتراكب السائل برفق باستخدام الأيزوبروبانول وشطف الجهاز بالماء المقطر. اترك الجل يتبلمر لمدة 30 دقيقة على الأقل في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك ، قم بإعداد جل تكديس بنسبة 3.2٪ ، مع إضافة PS و TM me مباشرة قبل الاستخدام. صب جل التكديس فوق الجل الفاصل وأدخل المشط بين الألواح الزجاجية ، وتجنب الفقاعات. بعد بلمرة جل التكديس ، قم بتبريد الجل إلى أربع درجات مئوية مباشرة قبل تحميل العينة.

قم بإزالة المشط واسحبه ببطء بزاوية إلى مستوى الجل. يسمح ذلك للهواء بالدخول إلى الجيوب بسرعة ، مما يحسن جودة الآبار لفصل محللة خلايا غسيل الكلى عن طريق تحميل الصفحة الأصلية الزرقاء 20 ميكرولترا من علامة الفيريتين و 40 ميكرولترا من محللة غسيل الكلى إلى الآبار الجافة عند أربع درجات مئوية ، تمتلئ الممرات الفارغة بكميات متساوية من عازلة غسيل الكلى. ثم تراكب العينات في كل بئر بمخزن مؤقت للكاثود البارد.

املأ الغرفة الداخلية بمخزن الكاثود البارد وغرفة الألسا بمخزن الأنود البارد. اعمل على أربع درجات مئوية وقم بتطبيق 100 فولت حتى تدخل العينات إلى هلام الفصل. ثم قم بزيادة الجهد إلى 180 فولت وقم بتشغيل الجل حتى تصل مقدمة القالب إلى نهاية الجل.

يستغرق الجري من ثلاث إلى أربع ساعات. بالنسبة لصفحة SDS ذات البعد الثاني ، قم بإعداد هلام SDS قياسي بنسبة 10٪ مع حارة واحدة كبيرة. حارة واحدة لعلامة الوزن الجزيئي وممر واحد لمجموعة من التحكم في المحللة التي تم خلطها مع المخزن المؤقت لعينة SDS وغليها لمدة خمس دقائق عند 95 درجة مئوية ، قم بإزالة هلام الصفحة الأصلي الأزرق في الألواح من جهاز الرحلان الكهربائي وقم بإزالة لوحة واحدة برفق.

قم بإزالة جل التكديس وقطع ممر جل الصفحة الأصلي الأزرق الذي يحتوي على البروتينات ذات الأهمية. ضع شريحة هلام الصفحة الأصلية الزرقاء في عينة SDS ، وقم بتخزينها مؤقتا واحتضانها لمدة 10 دقائق من درجة حرارة الغرفة على شاكر بعد الحضانة. اغلي شريحة الجل لفترة وجيزة في الميكروويف ، ثم احتضنها لمدة 15 دقيقة أخرى.

في المخزن المؤقت لعينة SDS على شاكر ، قم بإزالة مشط هلام SDS واملأ بعض المخزن المؤقت SDS في البئر ، وقم بتحميل شريحة هلام الصفحة الأصلية الزرقاء في البئر الكبير لجل SDS. تجنب فقاعات الهواء. قد ترغب في استخدام ملاقط للمساعدة لأن شريحة الجل يجب أن تكون بالضبط على جل التكديس.

تراكب الشريحة بمخزن مؤقت لعينة SDS، ثم قم بتحميل العلامة وعنصر تحكم المحلل. إجراء الرحلان الكهربائي ونقل البروتين وفقا للبروتوكولات القياسية. لتفسير النتائج ، من المهم معرفة أن موضع البروتين في صفحة SDS الأصلية الزرقاء ذات البعد الثاني يعطي دليلا على ما إذا كان البروتين جزءا من مركب MultiPro أم لا.

سوف تهاجر البروتينات الأحادية في قطري زائدي بسبب هلام التدرج في البعد الأول ، وكهلام خطي في البعد الثاني ، سيتم العثور على وحدات فرعية من مجمعات MultiPro أسفل القطر لتشكيل خط عمودي. إذا كان بروتين معين جزءا من مجمعات مميزة ، اكتشاف عدة بقع في خط أفقي. باختصار ، يسمح نهج صفحة SDS للصفحة الزرقاء ذات الأبعاد ثنائية الأبعاد بتحديد حجم التكوين المعقد MultiPro والوفرة النسبية.

في هذا العرض التوضيحي ، تم اكتشاف العديد من البروتيازوم أو الوحدات الفرعية بواسطة النشاف الغربي. يمكن اكتشاف الوحدات الفرعية beta two و MCP 21 كنقاط فردية مرتبة عموديا مما يشير إلى أنها جزء من نفس المجمعات. تم العثور على PA 28 في خط عمودي واحد مع بيتا اثنين و CP 21 وبالتالي جزء من نفس المجمع.

عند النظر إلى الخطوط الأفقية ، يمكن للمرء أن يرى أن بيتا اثنين و MCP 21 جزء من ثلاثة مجمعات متميزة. تم العثور على PA 28 فقط في واحد من تلك المجمعات. لذلك ، يمكن تحديد مجمعات MultiPro هذه على أنها 20 بروتيازوم ناجح 20 ثانية البروتيازوم.

جنبا إلى جنب مع P 28 و 20 S proteasome وحدها ، أوضحنا لك للتو كيفية فصل وتوصيف مجمعات MultiPro الأصلية من المحلل الخلوي باستخدام الصفحة الأصلية الزرقاء. عند القيام بهذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر غسيل الكلى للعينة بعناية. لتجنب ملامسة SDS والعمل دائما بأربع درجات ، نوصي بمقارنة المنظفات المختلفة للتحلل الخلوي لتحقيق سلامة المحرك والمجمعات الجميلة وأفضل قابلية للذوبان.

هذا كل شيء. شكرا على المشاهدة ونتمنى لك السعادة في تجاربك. سأدخل.