Formanti colonia cellulare (CFC) Analisi per cellule emopoietiche

Questa procedura valuta in un mezzo semi-solido, la capacità dei progenitori ematopoietici di proliferare e differenziarsi lungo diverse linee ematopoietiche per iniziare la coltura. Cellule CD 34 positive appena scongelate in presenza di citochine per favorire l'attivazione dopo due giorni. Eseguire la trasduzione retrovirale di un costrutto di test che esprime GFP aggiungendo le cellule CD34 positive attivate a una piastra precaricata con virus.

48 ore dopo, isolare le cellule GFP positive via fax, quindi piastrarle in un terreno semisolido di metilcellulosa integrato con fattori di crescita, incubare per circa due settimane fino a quando le colonie non compaiono sulla superficie. Infine, raccogliere le colonie, immobilizzare le cellule su vetrini utilizzando citosina e colorare con giza destra per la determinazione microscopica del lignaggio ematopoietico e dello stadio di maturazione. Questo metodo può fornire informazioni meccanicistiche negli studi sulla leucemogenesi, in particolare sugli effetti degli oncogeni sulla differenziazione ematopoietica.

Per vedere una coltura, scongelare rapidamente una fiala di cellule CD34 positive congelate a 37 gradi Celsius agitando delicatamente fino a quando non rimane un ultimo piccolo cristallo di ghiaccio e trasferire la sospensione cellulare in una provetta conica da 50 millilitri. Sciacquare delicatamente le cellule rimanenti dal flaconcino con un millilitro di terreno a temperatura ambiente, 2% F-B-S-I-M-D-M e aggiungerlo goccia a goccia nella provetta da 50 millilitri agitando delicatamente. Ora attendi tre minuti.

Continuare aggiungendo lentamente due millilitri di terreno mescolando delicatamente e nuovamente equilibrare per tre minuti. Ripetere questa procedura di aggiunta di terreno di uguale volume alla sospensione cellulare diluita a intervalli di tre minuti, agitando delicatamente tra un'aggiunta e l'altra fino a quando il volume finale raggiunge i 32 millilitri, raccogliere le cellule, centrifugare a 250 G per 10 minuti a temperatura ambiente e rimuovere il supernat lasciando circa 0,5 millilitri di terreno sopra il pellet. Procedere al lavaggio delle celle una volta sospendendo il pellet in 20 millilitri di terreno e centrifugando a 200 G per otto minuti A temperatura ambiente, rimuovere il sano e sospendere le celle in mezzo IMDM completo a circa mezzo milione di cellule per millilitro.

Infine, per determinare la concentrazione cellulare, prelevare 10 microlitri di sospensione in una microprovetta miscelata con lo stesso volume di soluzione di trian blue allo 0,4% e contare. Utilizzando un emocitometro, diluire le cellule da 10 a 5 cellule per millilitro aggiungendo un terreno IMDM completo integrato con il mix di colture di citochine attivanti, le cellule in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per due giorni il giorno della trasduzione, contare le cellule prima di iniziare il precaricamento del virus per determinare il numero di pozzetti da preparare al fine di preco A 24 pozzetti non trattati piastra di coltura tissutale. Aggiungere 400 microlitri di 25 microgrammi per millilitro, soluzione di retroactina a ciascun pozzetto e incubare per due ore a temperatura ambiente nella cappa di biosicurezza a flusso laminare.

Rimuovere la soluzione di actina retrò e codificare ogni pozzetto con il 2% di BSA incubando per 30 minuti a temperatura ambiente. Nel frattempo, scongelare le soluzioni di riserva per il virus e conservarle sul ghiaccio. Quindi aspirare la soluzione BSA caricare il virus aggiungendo 0,5 millilitri di preparato virale a ciascun pozzetto e centrifugare a 2.200 G a quattro gradi Celsius per 15 minuti.

Rimuovere la soluzione virale dai pozzetti e ripetere il caricamento del virus altre tre volte. Infine, sciacquare bene ciascuno con un mezzo IMDM freddo. Ora raccogli le cellule CD34 positive preattivate mediante centrifugazione e risospendi le cellule in un terreno IMDM completo fresco integrato con citochine, aliquota 0,15 milioni di cellule CD34 positive in ciascuno dei pozzetti, pozzetti codificati dal virus, pozzetti e incuba in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per due giorni al fine di raccogliere le cellule trasdotte delicatamente ma accuratamente.

Sospendi le cellule dalle piastre galleggianti del virus e filtra la sospensione attraverso un filtro cellulare da 50 micron in un tubo conico. Prelevare 10 microlitri di sospensione cellulare in un microtubo. Mescolare con un volume uguale di soluzione di trian blue e contare le cellule utilizzando un emocitometro.

Sciacquare ogni pozzetto con 0,8 millilitri di HBSS freddo con EDTA allo 0,02% e aggiungere alla stessa provetta di raccolta attraverso un filtro cellulare CEL Trix da 50 micron. Pellettare le celle mediante centrifugazione e lavare una volta con HBSS freddo. Risospendere il pellet di cella finale in HBSS con l'1% di BA e mantenere le cellule sul ghiaccio al buio per la successiva selezione delle celle, che viene tipicamente eseguita in una struttura di selezione delle celle ad alta velocità basata su un disegno sperimentale.

Scongelare energicamente il numero richiesto di aliquote di terreno di prova CFC per miscelare e lasciare riposare la provetta per almeno cinque minuti per far salire le bolle in superficie prima di aggiungere le cellule. A questo punto, prendete 3000 cellule selezionate trasdotte da virus in una microprovetta sterile contenente terreni freddi al 2% F-B-S-I-M-D-M e regolate il volume finale della sospensione a 0,3 millilitri. Sospendi le cellule e trasferisci l'intera sospensione cellulare in un'aliquota di tre millilitri di terreno di coltura metilico.

Creare una sospensione cellulare omogenea facendo vorticare vigorosamente. Lascia riposare il tubo per tre minuti. Per placcare le cellule, collegare un ago smussato calibro 16 a una siringa da tre millilitri e aspirare 2,2 millilitri.

Facendo attenzione a evitare l'assorbimento di bolle di grandi dimensioni, spingere fuori 1,1 millilitri ciascuno in due piastre di coltura tissutale non trattate da 30 millimetri e distribuire la miscela in modo uniforme ruotando le piastre duplicate in una piastra da 100 millimetri insieme a una ciotola per l'acqua. Continuando tre litri di coltura in acqua sterile per due settimane. Caratterizzare e valutare le colonie in base alla loro morfologia con un microscopio invertito a 40 x di ingrandimento in un piatto di coltura contrassegnato da una griglia di punteggio.

Al fine di documentare i risultati della coltura, scansionare l'intera piastra di dosaggio CFC utilizzando un normale scanner a 600 DPI ed effettuare micrografie fotografiche a bassa potenza di colonie rappresentative utilizzando un microscopio invertito dotato di una telecamera a colori per ulteriori analisi della differenziazione e della proliferazione, le cellule dell'intera piastra di saggio CFC vengono recuperate sospendendo in diversi volumi di temperatura ambiente il 2%F-B-S-I-M-D-M lavato e contato per le analisi morfologiche. Trasferire 30.000 cellule recuperate dalle piastre di saggio CFC su un vetrino. Utilizzando una centrifuga centrifuga STOs, asciugare all'aria i vetrini durante la notte per colorarli in modo efficiente.

Impostare una catena di montaggio di nove recipienti di colorazione contenenti soluzioni nel seguente ordine. Absolute methanol right gemsa stock solution right gemsa tampone, 50% di metanolo e acqua, due recipienti di acqua fosfato tampone pH sei e infine due recipienti di acqua. Posizionare i vetrini in un supporto per vetrini e immergerli nel metanolo assoluto per due minuti e nel sangue dal metanolo in eccesso.

Immergere immediatamente il supporto per vetrini e scrivere la soluzione di pasta gemsa per cinque minuti. Trasferire il supporto nel tampone gemsa destro pH 6,4 e incubare per 10 minuti. Immergere il vettore due volte nel metanolo al 50%, 10 volte in acqua e altre 10 volte nel recipiente d'acqua successivo e poi cinque volte nel tampone fosfato.

pH 6,0. Trasferire il vettore in acqua e incubare per due minuti. Ripetere il lavaggio nell'ultimo recipiente d'acqua.

Ora lasciare asciugare completamente i vetrini all'aria nel supporto. Rimuovere ogni vetrino e pulire la parte posteriore del vetrino con salviette Kim imbevute di metanolo per rimuovere le macchie. Mettere una goccia di cyto seal 60 e un vetro di copertura per sigillare.

Eseguire un conteggio differenziale di 500 cellule per ogni vetrino GM sostenuto utilizzando un microscopio. Ai fini di questo esperimento, le cellule sono divise in cinque categorie, cellule primitive, cellule mieloidi intermedie, cellule mieloidi mature, cellule eritroidi intermedie e cellule eritroidi mature. Ad esempio, rispetto all'espressione di controllo dei nuovi 98 falchi, un oncogene nove ha aumentato la formazione di colonie eritroidi rosse.

Questo impatto sul mercato dell'oncogene è chiaramente evidente quando le colonie vengono osservate a basso ingrandimento. Un ulteriore esame morfologico mediante GEM sustaining fornisce informazioni sul lignaggio e sul grado di maturazione della popolazione cellulare. In questo esempio, l'introduzione di nuovi 98 Hawks, un nove ha causato un aumento complessivo del numero di cellule con iperplasia eritroide e inibito l'inibizione della maturazione sia eritroide che mieloide.

Questo SA fornisce informazioni sulla differenziazione delle cellule ematopoietiche misurando la capacità di un preparato di cellule in ingresso di proliferare, differenziarsi e formare colonie in un mezzo semisolido.