Accoppiato a pinza registrazioni patch da Motor-neurone e muscolo scheletrico bersaglio in Zebrafish

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di ottenere registrazioni elettrofisiologiche simultanee del potenziale d'azione di un motoneurone e della risposta sinaptica associata nel muscolo bersaglio. Ciò si ottiene rimuovendo prima la pelle sul lato superiore del pesce. Il secondo passo della procedura consiste nell'esporre il midollo spinale rimuovendo tutte le cellule muscolari dorsali sovrastanti.

Il terzo passo della procedura consiste nell'esporre il muscolo veloce bersaglio rimuovendo lo strato superiore del muscolo lento. Il passaggio finale della procedura consiste nel bloccare il neurone primario o cap e il morsetto di tensione del muscolo scheletrico bersaglio. In definitiva, si possono ottenere risultati che mostrano le risposte sinaptiche nel muscolo che sono associate all'attivazione dei potenziali d'azione del motoneurone attraverso il morsetto di corrente simultaneo del motoneurone e il morsetto di tensione del muscolo bersaglio.

LaVar Super Fish ha offerto una combinazione di vantaggi, facilita il muscolo scheletrico del motoneurone accoppiato, registrando le piccole dimensioni dei permessi muscolari, l'efficace morsetto di tensione e le caratteristiche stereotipate del motoneurone cap consentono una facile identificazione e accesso vi. Ora, passo attraverso le procedure necessarie per stabilire il patch clamp di entrambi i muscoli neuronali Prima di iniziare la procedura. Prepara cinque soluzioni chiave, che includono la soluzione per il bagno, la soluzione per il bagno con la soluzione per il bagno Trica con la soluzione interna per i neuroni IDE e la soluzione interna per i muscoli.

Successivamente, raccogli una singola larva di pesce zebra di età compresa tra 72 e 96 ore e mettila nella soluzione del bagno con trica. Entro un minuto dall'esposizione all'anestetico, il pesce non risponderà. Per toccarlo posizionare il pesce sopra un piatto di plastica e con l'aiuto di uno stereomicroscopio decapitarlo con una lametta a doppio taglio.

Trasferire il pesce in una camera di registrazione di vetro ricoperta di sarda e riempita con soluzione di spigola. Crea un lembo di pelle vicino all'estremità rostrale del pesce con uno spillo che fornirà una presa adeguata per un paio di pinze sottili. Rimuovere la pelle sovrastante afferrandola vicino al perno rostrale con un paio di pinze sottili.

Sbucciare lentamente in direzione della coccola per rimuovere la pelle. Trattare il pesce con tre millilitri di soluzione da bagno con forma IDE per tre-cinque minuti per bloccare le contrazioni muscolari che potrebbero interferire con le registrazioni. Lavare cinque volte con una normale soluzione da bagno.

Rimuovere parte dello strato superficiale del muscolo su cinque o sei segmenti raschiando delicatamente con il lato di uno spillo di tungsteno. Trasferisci il pesce in un microscopio verticale situato in una gabbia di Faraday per schermare il rumore elettrico. Il microscopio è dotato di un tavolino fisso, di una lunga distanza di lavoro, di un obiettivo 40x e di uno zoom da 0,5 a quattro x.

Il microscopio è montato su uno stadio di traslazione XY motorizzato. Per spostare la preparazione tra nervo e muscolo ad alta potenza, l'uso di ottiche a contrasto interferenziale differenziale aiuta a visualizzare i neuroni con uno zoom di 0,5x. Utilizzare una pipetta da 15 micron a foro largo per rimuovere il muscolo sovrastante ed esporre il midollo spinale.

La pressione negativa viene applicata attraverso una siringa monouso da tre cc e le cellule muscolari vengono rimosse una ad una. Questa procedura viene ripetuta per cinque o sei segmenti dorsali del muscolo scheletrico. La stessa pipetta di cinghiale larga viene utilizzata anche per rimuovere i due strati superiori del muscolo ventrale per ottenere un muscolo scheletrico veloce bersaglio.

In questo modo si completa la preparazione per le registrazioni accoppiate e lo zoom del microscopio viene aumentato a circa 1,6x. I segmenti puliti vengono scansionati per individuare i neuroni del cappuccio. Ogni segmento HEMI del midollo spinale contiene un grande motoneurone con cappuccio di 10 micron di diametro.

Questo soma a forma di lacrima si trova superficialmente sotto la Jira spinale, vicino all'estremità più ampia del confine segmentale. Un neurone cappuccio viene scelto per la registrazione e il segmento di coccola associato, il campo muscolare bersaglio ventrale viene scansionato per verificarne l'integrità. Due elettrodi patch sono posizionati per la registrazione, uno per il neurone e un secondo per il muscolo.

L'elettrodo superiore ha una conicità poco profonda per la penetrazione della dura dura dura spina spinale e un'apertura della punta di circa due micron. L'elettrodo inferiore ha una conicità più ripida per la registrazione del morsetto di tensione a bassa resistenza del muscolo scheletrico. Posizionare l'elettrodo del neurone con un angolo di circa 30 gradi per penetrare nella dura spinale.

Circa mezzo segmento rostrale al neurone cappuccio selezionato fa avanzare l'elettrodo utilizzando un manipolatore assiale mentre applica una pressione positiva delicata e continua di circa 60 millimetri di mercurio. Quando l'elettrodo sfonda la dura, il neurone del cappuccio può essere spostato dalla perfusione dall'elettrodo che richiede un riaggiustamento del fuoco. Quando l'elettrodo tocca il neurone del cappuccio, SOMA, viene rilasciata una pressione positiva che di solito provoca l'immediata formazione di un giga seal.

Tuttavia, in alcuni casi in cui non si forma una guarnizione, diventa necessario applicare una leggera pressione negativa. Dopo la formazione della tenuta, il potenziale dell'elettrodo viene regolato a meno 80 millivolt e l'applicazione di una pressione negativa rompe la membrana cellulare. Il neurone cap è caratterizzato da una resistenza di ingresso da 140 a 180 mega ohm e un potenziale d'azione che supera i 40 millivolt.

Questo viene testato iniettando passi di depolarizzazione crescenti in modo incrementale sotto la pinza amperometrica fino a quando non viene suscitato il potenziale d'azione. Successivamente, il microscopio viene trasferito al muscolo ventrale utilizzando il traslatore motorizzato XY. Ad alta potenza, una cellula muscolare veloce viene scelta dal campo bersaglio.

L'elettrodo muscolare viene fatto avanzare verso la cellula muscolare bersaglio sotto pressione positiva, che quando viene rilasciata forma un giga sigillo, il potenziale dell'elettrodo viene regolato a meno 50 millivolt per inattivare i canali del sodio. E sotto un'aspirazione delicata, la membrana cellulare si rompe. Un calo della resistenza a 100-200 mega ohm e l'improvvisa comparsa dei grandi segnali transitori capacitivi entrano per testare la coppia.

La registrazione del motoneurone viene depolarizzata da iniezioni di corrente incrementalmente più grandi fino a quando non viene suscitato un potenziale d'azione. A questo punto, una corrente di placca terminale dovrebbe essere suscitata nella stimolazione continua del motoneurone muscolare a un hertz, si traduce in correnti di placca terminale senza guasti. Quando la frequenza dello stimolo viene aumentata a 100 hertz, le correnti della placca terminale fluttuano in ampiezza e vanno incontro a esaurimento funzionale entro 10 secondi dalla stimolazione.

In genere, la registrazione dei neuroni è stabile fino a un'ora, ma le cellule muscolari si deteriorano come riflesso di un aumento della resistenza in serie. Quando ciò si verifica, l'esperimento viene terminato o un'altra cellula muscolare viene bloccata con il patch. Tutte le registrazioni devono essere completate entro un'ora.

Una volta masterizzata una coppia, la registrazione può essere completata entro un'ora o mezza. E' anche possibile ottenere una o due coppie aggiuntive nei segmenti adiacenti. Una tipica giornata di registrazione produrrà due o tre coppie.

Le registrazioni accoppiate del muscolo scheletrico dei motoneuroni offrono un'opportunità unica per esplorare il funzionamento fondamentale della trasmissione neuromuscolare. Se utilizzato in combinazione con le linee di pesci mutanti Motility, può individuare la fonte della disfunzione neuromuscolare e fornire nuove informazioni sui meccanismi alla base delle malattie umane come la sindrome metastatica.