I dosaggi farmacologici genetica e funzionale di manipolare Rigenerazione del Planaria Japonica Dugesia

L'obiettivo generale dei seguenti esperimenti è quello di eseguire e manipolare saggi rigenerativi in platelminti di Parian utilizzando metodi di knockdown farmacologici e/o genetici. Il primo passo è padroneggiare il test di base di amputazione e rigenerazione. Successivamente viene mostrato come i farmaci possono essere utilizzati per sovvertire la polarità rigenerativa, ad esempio, per produrre animali a due teste.

Infine, viene fornita una descrizione di come eseguire l'RNAi in vivo mediante alimentazione. Al fine di esaminare gli effetti della perdita di funzione di geni specifici. I risultati mostrano che il trattamento con il quintale sovverte la rigenerazione per produrre vermi a due teste e l'abbattimento genetico di una betaina e di un'isoforma produce un fenotipo grossolanamente simile.

Ciao, mi chiamo John Chan, uno studente laureato nel laboratorio di marcia, e dimostrerò queste procedure. La dimostrazione visiva di questi metodi è una causa importante, anche se di per sé nessun singolo passo è difficile. La dimostrazione complessiva di queste tecniche aiuterà i ricercatori che si avvicinano per la prima volta a questo sistema di modelli.

In preparazione al test, interrompere l'alimentazione di una coorte di circa 30 parian per almeno cinque giorni dopo la fame. Il verme dovrebbe essere lungo tra gli otto e i 10 millimetri il giorno del test. Sciacquare una vaschetta di ghiaccio livellata pre-pro con acqua e coprire la superficie piana ghiacciata con pellicola trasparente utilizzando una pinza.

Metti una carta da filtro sulla pellicola trasparente. Inumidire la carta da filtro con alcune gocce di acqua di sorgente utilizzando una pipetta di trasferimento, posizionare non più di 20 plin sul filtro. Se necessario, i vermi possono essere riposizionati sul filtro ripipettandoli con altra acqua di sorgente.

Una volta che i vermi sono in posizione, rimuovere il liquido in eccesso utilizzando un bisturi, amputare la testa praticando un unico taglio a circa metà strada tra l'apice anteriore dell'animale e l'estremità anteriore della faringe. Successivamente, amputa la regione della coda praticando un singolo taglio a circa metà strada tra l'estremità della coda dell'animale e l'estremità posteriore della faringe. Rimuovere il muco in eccesso sul bisturi usando un tovagliolo di carta inumidito con etanolo al 70% dopo il taglio, quindi rimuovere l'etanolo in eccesso dal bisturi prima di tagliare di nuovo.

Raccogliere il filtro con una pinza e trasferirlo in una capsula di Petri contenente acqua di sorgente. Attendere circa tre minuti per la chiusura della ferita, che è osservabile da un pizzicamento e dall'oscuramento della ferita. Sciacquare i frammenti del tronco dalla carta da filtro in una capsula di Petri contenente il mezzo desiderato per il saggio di rigenerazione e trasferirli in un incubatore termostatico impostato a 24 gradi Celsius.

Segna il fenotipo rigenerativo dopo circa una settimana. Quando le strutture rigenerate sono identificabili, preparare un quintale da 200 millimolari o stock di PZ Q solubilizzando il farmaco in DMSO da utilizzare fresco lo stesso giorno. Quindi, preparare 50 millilitri di soluzione contenente farmaco aggiungendo 22,5 microlitri del brodo PZ Q al vortice di sali majic tamponati per circa un minuto.

Per garantire la dispersione, posizionare i vermi su carta da filtro inumidita con acqua di sorgente e amputare sia la regione della testa che quella della coda come descritto nel saggio di rigenerazione della frammentazione del tronco Dopo l'amputazione e la chiusura della ferita, trasferire i frammenti del tronco in una capsula di Petri di acqua di sorgente. Sostituire il terreno con la soluzione di PZ Q a 90 micromolari e trasferire la piastra di Petri nell'incubatore a 24 gradi Celsius. Dopo 24-48 ore, sostituire il terreno contenente PZ Q con acqua di sorgente, lavare il verme più volte, rimettere i vermi nell'incubatrice e, dopo una settimana, valutare il fenotipo bipolare o a due teste dei vermi prima del test.

Preparare l'omogeneizzato di fegato di pollo, scartare le sezioni grasse di colore giallo dal brodo alimentare, quindi frullare la purea di fegato rimanente attraverso un pasticcio. Filtro e sospensione aqua spend per lo stoccaggio. Successivamente, preparare i globuli rossi bovini o RBC di Ali, citando la fornitura in campioni da un millilitro conservati a una temperatura negativa di 20 gradi Celsius.

Usa i vermi che sono stati affamati per cinque giorni e raggruppali in tre coorti. Il gene di interesse controllo positivo un gene con fenotipo RNAi noto e controllo negativo. Un gene senza fenotipo RNAi.

Per ogni coorte, usa circa 250 vermi lunghi da otto a 10 millimetri. Scongelare una scorta di e coli per ogni coorte che esprime RNA a doppio filamento, mirando ai geni di interesse insieme a una provetta di pollo, fegato, omogeneizzato e una provetta di globuli rossi. Pellettare i batteri mediante centrifusion a 13.000 Gs.Per un minuto, rimuovere il supernat e risospendere il pellet in 700 microlitri di due terreni XYT.

Ricentrifugare, scartare il surnatante e quindi posizionare il pellet sul ghiaccio. Creare una punta per pipetta P 200 di grande diametro tagliando accuratamente la punta, risospendere il pellet batterico in 150 microlitri di omogeneizzato di fegato di pollo più 50 microlitri di globuli rossi per creare una miscela di alimentazione RNAi. Rimuovere le bolle d'aria con un breve impulso di centrifugazione per l'alimentazione.

Rimuovi la maggior parte dell'acqua dalla vasca di plastica contenente i vermi, lasciando una profondità di circa un pollice. Agita la vasca per concentrare i vermi al centro di questo contenitore. E poi pipettare la miscela di alimentazione RNAI in un cerchio, radunando i vermi.

Utilizzare una pipetta di trasferimento per convincere con cura eventuali fuggitivi a rientrare nella miscela di alimentazione RNAi senza disturbare gli altri commensali dopo aver mangiato per circa un'ora, identificare il parian che si è nutrito bene e rimuovere eventuali vermi che non sembrano ben nutriti. Vermi ben nutriti. Mostra una colorazione rosso intenso dovuta ai globuli rossi ingeriti.

Sostituire con cura la soluzione di alimentazione con acqua fresca di sorgente, facendo attenzione a ridurre al minimo il disturbo per prevenire l'ingestione di cibo. Per fare ciò, localizzare delicatamente i vermi su un lato della vasca utilizzando un tubo di trasferimento. Versare l'acqua di merda e sostituirla con cura con acqua fresca versata lungo la parete opposta della vasca res immergere parian rapidamente come esposizione prolungata all'aria.

Provoca anche l'ingestione di cibo in modo sciolto. Sigillare il coperchio del contenitore e rimettere i vermi nell'incubatrice a 24 gradi Celsius. Ripetere questo protocollo di alimentazione dell'RNAi su più cicli intervallati da cicli rigenerativi per lo screening finale dei fenotipi RNAi.

Qui viene mostrato un programma standard di alimentazione e rigenerazione efficace per molti geni. F rappresenta il protocollo di alimentazione e X rappresenta il saggio di rigenerazione. In totale, il protocollo richiede circa un mese e può essere modificato per diversi geni includendone meno, rappresentati da parentesi F o più alimentazioni, poiché il protocollo ottimale dipenderà da fattori come la stabilità dell'mRNA, la localizzazione tissutale, le proteine, il P durante o lo sviluppo di un fenotipo che preclude più cicli di alimentazione dopo la rigenerazione.

Di seguito sono riportati i risultati tipici del saggio di rigenerazione del tronco. A sinistra, sopra uno schema che indica i tagli di amputazione, è mostrato un pario. A destra c'è un corso temporale di rigenerazione dei frammenti del tronco che avviene nell'arco di sette giorni con macchie oculari che compaiono entro il terzo giorno.

Qui, la sovversione farmacologica della rigenerazione del frammento del tronco da parte di PZ Q.Il trattamento ha prodotto vermi a due teste utilizzando RNAi contro il gene DJ 61. In un FX Il protocollo di alimentazione FX si traduce in un fenotipo ilis, la perdita di una risposta di avversione alla luce osservata dopo un protocollo di alimentazione FFFX si traduce in due vermi RNAi DJ PC immobili colorati di rosso rispetto al controllo mobile. RNAi verde macchiato di verme abbattuto di DJ beta catina in uno.

L'utilizzo di un protocollo di alimentazione FXFX provoca la rigenerazione di una testa dalla ferita posteriore. Seguendo queste procedure, i ricercatori saranno in grado di indirizzare i geni di interesse per la loro ricerca utilizzando metodi di knockdown o agenti farmacologici selettivi al fine di esplorare il loro ruolo nella biologia pariana e nella rigenerazione dei tessuti.