Humanos Linhas tumor neuroendócrino de células como um modelo tridimensional para o estudo da terapia de tumores humanos Neuroendócrino

O objetivo geral do experimento a seguir é desenvolver um método fácil e simples para produzir esteróides tumorais neuroendócrinos tridimensionais uniformes e um método simples para processar a incorporação de HistoGel para estudar a histologia desses esteróides. Isso é conseguido revestindo uniformemente placas de 24 poços com aeros nos quais as células tumorais neuroendócrinas humanas em uma única suspensão celular são semeadas. A placa é então incubada em um agitador orbital na incubadora durante a noite a uma velocidade inferior a 40 RPM e, em seguida, transferida para uma prateleira estável na incubadora.

O esferóide se formará no terceiro ou quarto dia, e seu crescimento e integridade são monitorados por microscopia de contraste de fase para estudar sua histologia. O esteróide 3D é incorporado em HistoGel aquecido antes da obtenção de resultados de processamento de parafina de rotina que mostram o crescimento de esteróides 3D de tumor neuroendócrino com base em imagens tiradas durante a microscopia de contraste de fase. A histologia do esteróide 3D é analisada por h e e coloração imuno-histoquímica de seções de bloco de parafina dos esteróides 3D.

A principal vantagem dessa técnica sobre o método existente é que ela é simples, fácil, confiável e econômica. Este método pode facilitar a pesquisa no campo da descoberta de medicamentos, ajudando a identificar rapidamente medicamentos terapêuticos para pacientes com tumores neuroendócrinos. Em geral, os indivíduos novos neste método terão dificuldade inicialmente pelo menos para crescer uniformemente moldados em esteróides 3D de tamanho.

A chave para isso é garantir que suas placas de 24 poços sejam uniformemente revestidas com agros e também garantir que suas suspensões unicelulares estejam bem dispersas e sejam precisas. Para entender a histologia dos esteróides 3D, precisamos realizar o processamento paren e a coloração imunoquímica. A incorporação histológica dos esteróides 3D é o passo chave que será demonstrado no final de hoje: Para preparar 1% de augúrios para revestir placas de 24 poços, adicione um grama de aeros a 100 mililitros de água deionizada em uma garrafa de 250 a 500 mililitros e autoclave para esterilizar os aeros após a esterilização.

Transfira a garrafa para um banho-maria a 70 graus Celsius por cerca de uma hora. Para que os aeros esfriem a 70 graus Celsius, os aeros devem ser mantidos estéreis o tempo todo. Em um gabinete de biossegurança, use uma pipeta repetidora para dispensar 200 microlitros de aeros em cada poço de 2 24.

Placas de fundo bem planas para este protocolo. Qualquer tipo de placas de fundo plano de 24 poços funcionaria, desde que as placas possam ser visualizadas sob um microscópio de contraste de fase, gire os aeros ao redor do poço para cobrir o poço uniformemente. 200 microlitros de aeros são ideais para formar uma superfície côncava para permitir que o esferóide forme formas esféricas consistentes.

Após cerca de 10 minutos, as placas de 24 poços revestidas com aeros estão prontas para serem usadas. As células bon one usadas neste experimento são tumor neuroendócrino pancreático humano ou células NET mantidas em D-M-E-M-F 12 com meio 10% FBS em uma placa de cultura de tecidos estéreis em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Quando as células de ligação monocamada atingem 70 a 80% de fluência de Co, as suspensões de célula única são preparadas em um gabinete de biossegurança.

Remova o meio e lave as células com PBS duas vezes desalojar as células do prato adicionando um mililitro de viagem e incubando a 37 graus Celsius por cinco minutos. Verifique ao microscópio se todas as células estão separadas do prato e, em seguida, adicione nove mililitros. Meio de crescimento para a tripsina.

As células oculares pipetam as células para cima e para baixo algumas vezes para garantir uma suspensão uniforme de uma única célula. Use um filtro de células de 70 mícrons para filtrar as células. Colete as células filtradas após realizar uma contagem de células, prepare uma suspensão de 5.000 células por mililitro em DME 12 com crescimento de 10% de FBS. Média.

O número de células a serem colocadas na placa deve ser determinado empiricamente com base no tamanho das esferas no sexto dia. Idealmente, você gostaria de ter um tamanho de bolha entre 300 a 400 nanômetros e diâmetro. Por esse motivo, plaqueamos mil células por 200 microlitros por poço.

Para iniciar este procedimento, sobreponha 200 microlitros da suspensão de célula única em cada poço revestido com aeros das placas de 24 poços previamente preparadas, sele as placas de 24 poços com fita de teto estéril para evitar a evaporação. Coloque as placas de 24 poços revestidas aero contendo células bon one em um agitador orbital em uma agitação muito lenta em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono no ar, incube durante a noite na manhã seguinte, mova as placas para uma plataforma estável e mantenha as culturas crescendo na incubadora. A cada três dias.

Adicione 200 microlitros de meio de crescimento a cada poço das placas. Para evitar perturbar o phe, toque a ponta da pipeta ao lado do poço e deixe o meio fluir pela parede para o poço monitorar a formação de OID nas placas de 24 poços sob um microscópio. O tratamento medicamentoso dos esteróides 3D é iniciado no sexto dia de cultura.

Quando os esferoides têm cerca de 300 a 400 mícrons de diâmetro, isso é denotado como dia zero para tratamento medicamentoso no dia seis. Cada poço das placas contém cerca de 400 microlitros de meio para garantir que os tratamentos com medicamentos estejam em uma concentração final de um x em cada poço para cada dose de tratamento, faça três vezes a concentração desejada, dilua a quantidade apropriada de estoque de medicamentos em cinco mililitros de meio de crescimento em um tubo cônico de 15 mililitros, o que é suficiente para oito réplicas do PHE em cada linha das placas de 24 poços são caracterizadas como dose veicular 1, 2, 3, 4 e cinco. Existem quatro repetições para cada dose de tratamento em cada placa de 24 poços.

Normalmente, os phe 3D são tratados em pelo menos 2 placas de 24 poços, resultando em pelo menos oito repetições para cada dose de tratamento. Antes de adicionar o tratamento a cada um, gire bem as placas de 24 poços para garantir que toda a condensação na fita do teto entre no poço devido ao recurso flutuante do esteróide 3D. O meio em cada poço não é removido após a centrifugação.

Para evitar perturbações do esfeto, adicione cuidadosamente 200 microlitros de cada dose de tratamento nos poços apropriados ao longo da parede de cada um. Vede bem as placas de 24 poços com fita de teto e incube as culturas em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono no ar. Monitore as culturas de esteróides 3D em cada ponto de tempo escolhido após o tratamento medicamentoso com um microscópio de contraste de fase.

Uma objetiva de cinco x é ideal porque o PHE supera rapidamente o campo de imagem com uma objetiva de 10 x. Adquira imagens do esteróide em cada poço em cada ponto de tempo antes do HistoGel. Incorporando a rede, os esteróides 3D são coletados das placas de 24 poços e fixados em 10% de formina.

Coloque um tubo de HistoGel frio em um béquer cheio de água. Aqueça o copo no micro-ondas por um minuto ou até que o gel esteja completamente liquefeito. Mantenha o tubo no mesmo copo cheio de água durante o procedimento.

Usando uma pipeta de plástico descartável. Transfira todo o esteróide para um molde criogênico de biópsia. Deixe o esteróide descansar por um minuto para afundar até o fundo do molde criogênico de biópsia.

Tente se livrar do líquido no molde criogênico de biópsia com lenços umedecidos. Empurre muito suavemente o esteróide para o centro na parte inferior do molde criogênico de biópsia usando um palito de dente. Em seguida, ao usar a pipeta Pasteur para manter suavemente o esteróide no centro do molde criogênico de biópsia.

Adicione uma fina camada de HistoGel aquecido ao molde criogênico de biópsia. Não adicione muito HistoGel. Apenas o suficiente para estabilizar os esteróides no centro.

Deixe o esteróide no HistoGel descansar por um a dois minutos em temperatura ambiente ou até que o HistoGel esteja solidificado. Encha o resto do molde criogênico de biópsia com HistoGel aquecido e deixe-o solidificar a temperatura ambiente por cerca de 10 minutos. Pouco antes de estourar este bloqueio de OIDs HistoGel do molde criogênico de biópsia.

Deixe o molde criogênico no gelo por um minuto e, em seguida, retire o bloco HistoGel esteróide intacto. Enrole o bloco em um pedaço de filme biológico e coloque-o em um de tecido e biópsia. Armazene o tecido e o de biópsia em um recipiente com 70% de etanol.

Posteriormente, os procedimentos de processamento de tecidos de rotina para inclusão de parafina são realizados quando cultivados em placas de 24 poços codificadas em aeros. Diferentes linhagens celulares net mostram diferentes morfologias, como visto aqui. A linha celular líquida pancreática humana se liga a um e a linha celular líquida pulmonar humana H 7 27 formaram esteróides 3D.

Em contraste, qgp um. As células da rede pancreática humana mostram grandes massas porosas semelhantes a uvas, que não são consideradas esteróides. Após a ligação de semeadura, uma célula na formação de esteróides multicelulares de placa de 24 poços revestida com agros normalmente ocorre no terceiro ou quarto dia, e o esteróide se torna mais redondo no sexto dia.

Devido à limitação de nutrientes e oxigênio. As células no núcleo denso do esteróide começam a morrer por volta do dia 10 e, no dia 17, os esteróides começam a se desintegrar. Devido ao grande tamanho ou, em alguns casos, à ejeção do cordão necrótico, o esteróide normalmente pode crescer até 1000 mícrons de diâmetro.

Neste experimento, o esteróide 3D do sexto dia foi escolhido como ponto de partida para o tratamento com os triciclos inibidores de histona estatina A ou TSA. Foi relatado anteriormente que os inibidores da histona desacetilase exibem efeitos antiproliferativos e proto-inflamatórios nas células da rede. Essas imagens rastreiam a morfologia dos esteróides 3D no início do tratamento e 24, 48, 72 e 96 horas depois.

V indica tratamento com o veículo, que é DMSO neste caso. D um a D cinco representam o tratamento com doses crescentes de TSA do tamanho de cada indivíduo. O OID foi estimado automaticamente por um programa de computador MATLAB desenvolvido sob medida.

Pelo menos oito sphs foram medidos por dose de tratamento com TSA em cada ponto de tempo, e os resultados são plotados neste gráfico em relação ao veículo. Todas as doses de TSA mostraram algum grau de inibição do crescimento em OIDs 3D. Em concentrações TSA de 125 nano molares e 250 nano molares, o crescimento de esteróides 3D foi fortemente suprimido para entender a histologia do esteróide 3D líquido.

A coloração H e e e a coloração imuno-histoquímica foram realizadas em esteróide 3D cultivado por 17 dias. O KI 67 é um marcador para células em proliferação, enquanto a caspase clivada três é um marcador para células apoptóticas. Os resultados indicam que as células da camada externa do esteróide 3D estão proliferando ativamente, mas as células dentro do núcleo são principalmente necróticas ou apoptóticas.

Após este procedimento, ensaios adicionais, como o ensaio de brilho do título celular, podem ser realizados para determinar a viabilidade celular desses esteróides 3D. Após seu desenvolvimento, essa técnica pode ser estendida para 96 placas de parede para realizar telas de alto rendimento, o que facilitará a descoberta de medicamentos terapêuticos na pesquisa do câncer.