Поколение человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток из периферической крови с помощью STEMCCA Lentiviral векторного

Протокол демонстрирует, как эффективно генерировать индуцированные плюрипотентные стволовые клетки человека из четырех миллилитров периферической крови. В нулевой день изолируйте и размножите мононуклеарные клетки из образца периферической крови. Трансдуцировать первичные клетки с помощью перепрограммированного стволового совектора.

На девятый день продолжайте помещать трансдуцированные клетки в инактивированные мышиные, эмбриональные, фибробласты и культуру в течение примерно трех недель. Выбирайте колонии HESC для расширения и персонажей. Результаты иммунофлуоресцентного окрашивания для экспрессии маркеров плюрипотентности, таких как SS EEA 4, первое испытание 60 и испытание 180 1.

Демонстрация эффективного получения индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека. Использование противовирусного вектора из стволовых клеток для получения индуцированных человеком стволовых клеток обладает рядом преимуществ по сравнению с другими существующими методами. Возможно, наиболее привлекательным является общая простота подхода, поскольку он требует легкого доступа к донорской ткани, и под этим я имею в виду легкодоступную иностранную периферическую кровь.

Наиболее важными характеристиками этого метода являются эффективность программирования rep и качество получаемых клонов IPS-ячеек. Демонстрировать процедуру будут Андреа Джануари Саммер, научный сотрудник моей лаборатории, и Сара Розелл, аспирант лаборатории Джорджа Мерфи. И все это в нулевой день.

Наберите четыре миллилитра периферической крови в пробирку для приготовления клеток вакутайнера с цитратом натрия. Переверните трубку от восьми до 10 раз в течение двух часов после сбора. Центрифугируйте образец при 1800 G в течение 30 минут при комнатной температуре, чтобы собрать мононуклеары.

Отсасывайте плазму и пипеткой выводите охристую оболочку из клеточного слоя между гелевым барьером и плазмой. Переложите пальто Buffy в стерильную коническую центрифужную пробирку объемом 15 миллилитров и доведите общий объем до 10 миллилитров с помощью стерильного PBS. Переверните пробирки несколько раз и центрифугируйте при 300 G в течение 15 минут.

Ройс суспендирует клеточную гранулу в 10 миллилитрах стерильной PBS, проводит подсчет клеток, а затем перекладывает одну-два раза по 10-шестую клетку в стерильную 15-миллилитровую хроническую центрифугу. Соберите клетки центрифугированием и повторно суспендируйте гранулу в двух миллилитрах расширяющей среды. Затем засейте изолированные мононуклеарные клетки в одну лунку 12-луночного планшета и культивируйте при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа.

Соберите оставшиеся клетки центрифугированием и заморозьте запасы примерно в два раза по 10-шестую ячейки во флаконе FBS, содержащей 10% ДМСО, на третий и шестой дни. Переложите клетки в стерильную коническую пробирку объемом 15 миллилитров и промойте лунку одним миллилитром среды стволовых клеток QBSF 60. Собрать адгезивные клетки.

Соберите клетки центрифугированием, повторно суспендируйте клеточную гранулу в двух миллилитрах эм. Затем перенесите клеточную суспензию в одну лунку 12-луночного планшета и верните культуру в инкубатор на девятый день. Переложите клетки в стерильную коническую пробирку объемом 15 миллилитров и промойте лунку один раз одним миллилитром среды для стволовых клеток QB SF 60, чтобы собрать адгезивные клетки, центрифугируйте культуру при 300 G в течение 10 минут.

Затем ресуспендируйте клеточную гранулу в одном миллилитре свежего ЭМ, содержащем пять микрограммов на миллилитр полимозгового и STEM-лентивируса для MOI от одного до 10. Затем переложите суспензию в одну лунку 12-луночного планшета и центрифугируйте при 2, 250 об/мин в течение 90 минут при температуре 25 градусов Цельсия. Добавьте еще один миллилитр свежего ЭМ, содержащего пять микрограммов на миллилитр полимозга, в общей сложности два миллилитра ЭМ, и поместите тарелку в инкубатор для клеточных культур на 10-й день.

После сбора клеток, как показано ранее, ресуз суспендирует клеточную гранулу в двух миллилитрах ЭМ-культуры. Трансдуцированные клетки в одной лунке 12-луночного планшета на 11-й день покрывают лунки шестилуночного планшета 0,1% желатина, затем инактивированные эмбриональные фибробласты мыши в двух случаях по 10-пятую лунку в метамфетаминовой среде. Подготовьте три лунки на одну инфекцию.

На следующий день соберите трансдуцированные мононуклеарные клетки, как показано ранее. После центрифугирования клеточную гранулу ресуспендируют в трех миллилитрах метамфетаминовой среды, содержащей BFGF. Аскорбиновая кислота и факторы роста.

Теперь отсасывайте среду из MES-планшета один миллилитр МЦ на лунку ОФМ. Затем добавьте 1,5 миллилитра полной метамфетаминовой среды, центрифугируйте пластину при 500 об/мин при 25 градусах Цельсия в течение 30 минут. Затем культивирование при 37 градусах Цельсия и 5% углекислом газе в течение двух дней, начиная с 14-го дня.

Пополняйте среду через день 2,5 миллилитрами метамфетаминовых сред, содержащих 10 нанограммов на миллилитр BFGF и 50 микрограммов на миллилитр аскорбиновой кислоты, но без факторов роста. Примерно на 20-й день, когда появятся небольшие колонии, ежедневно кормите клетки двумя миллилитрами среды человеческих эмбриональных стволовых клеток между 30 и 40 днями. Выберите каждую колонию и перенесите в отдельные лунки 12-луночной пластины, перед которой будет введена инактивированная математика, содержащая один миллилитр на среду HESC плюс питательные ячейки ингибитора горных пород ежедневно.

Впоследствии, с помощью одного миллилитра среды HESC без ингибитора горных пород, плюрипотентные стволовые клетки, полученные из моноцитов человека, теперь готовы к иммунофлуоресцентному окрашиванию маркеров плюрипотентности, а также к эксцизию интегрированной перепрограммирующей кассеты. Во время этого протокола клетки претерпевают несколько морфологических изменений от P BMC до генерации человеческих I PSC. В нулевой день выделенные мононуклеарные клетки из периферической крови культивируются в расширяющей среде через девять дней.

Наблюдаются гроздья винограда, похожие на скопления клеток, что позволяет предположить, что клетки здоровы и размножаются до трансдукции. Примерно на 21-й день после того, как клетки были размещены на MA, образуются колонии. На 30-й день колонии IPSC демонстрируют типичную для человеческих эмбриональных стволовых клеток морфологию.

Этот иммунофлуоресцентный анализ ПИИК, полученных из pbmc, показывает экспрессию маркеров плюрипотентности SSEA 4, первое испытание 60 и испытание 180 1. I ПСК также положительно влияют на щелочную фосфатазу. На этих изображениях показаны этапы получения свободных от трансгенов ИПК путем трансфекции с плазмидной коэкс, экспрессирующей CRE-рекомбиназу и геном устойчивости к пур-мицину, как описано в Summers etal 2010, в сравнении с ПИИК до того, как будет наблюдаться трансфекционная гибель клеток.

Примерно через 10 дней после трансфекции биогенных анализов крови на отдельных колониях появляются новые колонии из резистентных клеток Анализы крови на отдельных колониях подтверждают, что эксцизия трансгенных дорожек 1, 3, 5 и 7 показывает присутствие трансгена в клонах IPSC до эксцизии. Эти бамы отсутствуют на дорожках 2, 4, 6 и 8 после удаления трансгена. После просмотра этого видео вы сможете последовательно и надежно генерировать высококачественные, нормальные или специфические для болезни человеческие IPS-клетки из небольшого количества периферической крови любого человека.

Такой подход упрощает процесс программирования REP, чтобы сделать его широко доступным для сообщества стволовых клеток. В то же время обеспечивается базовый уровень для создания более однородной популяции линий стволовых клеток.