Do genoma deleções de genes em Streptococcus sanguinis Por PCR de Alto Rendimento

O objetivo geral deste procedimento é fazer deleções de um único gene em todo o genoma em estreptococos sanguíneos por PCR de alto rendimento. Isso é feito obtendo primeiro três amplicons por amplificação de PCR de alto rendimento, incluindo o gene de resistência a antibióticos, bem como as sequências de DNA a montante e a jusante do gene alvo. O segundo passo é obter o amplicon de PCR recombinante linear usando três amplicons de PCR como modelos.

Em seguida, as células sanguíneas competentes são preparadas. A etapa final é transformar o amplicon linear de PCR recombinante em células sangüíneas competentes. Em última análise, a amplificação de PCR do cólon A e o sequenciamento de DNA são usados para verificar os mutantes corretos.

A principal vantagem desta técnica sobre outros métodos esgotados, como nocaute de plasmídeo suicida, é que este método pode criar o mutante de deleção de todo o genoma diretamente usando alto rendimento. Os primers de PCR podem ser projetados e sintetizados conforme descrito no protocolo escrito usando scripts internos baseados na sequência do genoma SK 36 do streptococcus sanguineous. Três conjuntos de primers foram projetados para amplificação da sequência a montante de uma quilobase do gene alvo, a codificação ENC do gene A PHA três, a proteína de resistência à canamicina e a sequência a jusante de uma quilobase do gene alvo.

Primers específicos do gene. R um e F três são projetados com base nas cinco sequências primas e três primas do gene alvo para amplificar o alto rendimento da região a montante ou a jusante de uma quilobase dos genes sanguíneos do alvo. Primeiro, monte uma mistura de coquetel de PCR no gelo em um tubo cônico de 15 mililitros.

Veja o texto para os componentes da mistura de PCR contendo DNA genômico sangüíneo transfere 23 microlitros da mistura para cada poço de uma placa de PCR de 96 poços usando uma pipeta multicanal para a sequência a montante do gene alvo transfere um microlitro de cada F1 e R um de 10 placas de primer de trabalho micromolares para a placa de PCR usando a pipeta multicanal. Faça o mesmo com os primers F três e R três para amplificar a sequência a jusante do gene alvo. Sele a placa de PCR e realize a amplificação a 94 graus Celsius por um minuto, seguida de 30 ciclos de 94 graus Celsius por 30 segundos.

54 graus Celsius por 30 segundos e 68 graus Celsius por 1,5 minutos. Após a amplificação, prepare um gel de 1% de aros contendo um brometo de encaixe com carregamento de pipeta multicanal de encaixe de 48 poços. Misture quatro microlitros do produto de PCR com um microlitro de cinco tampão de carga XDNA.

Em uma placa de 96 poços, carregue as amostras em um gel aros usando pipetas multicanal de 10 microlitros. Execute a eletroforese a 135 volts por 30 minutos. Examine a banda no gel sob um sistema de documentação e análise UVP.

Purifique os produtos de PCR pelo kit de purificação de PCR 96 de link puro usando centrifugação de acordo com as instruções do fabricante para iludir o DNA. Adicione 40 microlitros de água estéril duplamente destilada a cada poço da placa de ligação. Escolha aleatoriamente vários amplicons purificados na placa para examinar as concentrações de DNA.

Usando um espectrofotômetro NanoDrop, ajuste a concentração de amplicons na placa para aproximadamente 10 nanogramas por microlitro. Em seguida, use eco R one para digerir um plasmídeo contendo a gisette de resistência à canamicina para que possa servir como modelo de PCR. Purifique o plasmídeo digerido usando o kit de purificação rápida de PCR kayak e ajuste o DNA do plasmídeo linear para a concentração final de DNA de 10 nanogramas por microlitro.

Monte uma mistura de PCR de 25 microlitros para o amplicon de de resistência à canamicina, incluindo F dois e R dois primers, conforme listado no procedimento escrito. Acompanhando este vídeo, prossiga para realizar a amplificação por PCR conforme as instruções aqui. Para examinar o produto de PCR, realize eletroforese em gel em um gel 1%aros.

Em seguida, agrupe uma grande parte dos amplificadores de de resistência a cana de 10 indivíduos purificados por PCR. Ajuste a concentração do amplicon para 10 nanogramas por microlitro. O aspecto mais difícil deste procedimento é obter o requerente de PCR linear final competente de seus três requerentes de PCR t.

Para garantir o sucesso, os três requerentes de PCR são ajustados para uma quantidade quase igual. Combine um microlitro de cada um dos três aons de PCR de 10 nanogramas por microlitro em uma placa de PCR, bem como o modelo de PCR. Em seguida, prepare a mistura de PCR, incluindo os três iniciadores F1 e R, conforme listado no procedimento escrito.

Em seguida, execute a amplificação por PCR das amostras. Examinar os AMPLICONS da PCR num gel aros após a purificação e quantificação dos amplicons da PCR. Como antes, congele os amplificadores de PCR recombinados a 20 graus Celsius negativos.

Para começar, prepare Todd Hewitt e meio de soro de cavalo conforme instruído no procedimento escrito que acompanha este vídeo: alíquota de dois mililitros de meio e 10 mililitros de meio em dois tubos cônicos de 15 mililitros. Inocular cinco microlitros de estoque descongelado sangüíneo SK 36 que havia sido congelado a 80 graus Celsius negativos em dois mililitros de meio. Incube a cultura bem fechada durante a noite a 37 graus Celsius.

Também pré-incube o tubo médio de 10 mililitros nas mesmas condições após a incubação durante a noite. Transfira 50 microlitros da cultura para o tubo médio de 10 mililitros. Incube o tubo a 37 graus Celsius por três horas.

Imediatamente após a incubação, adicione dois microlitros de peptídeo estimulador de competência SK 36 sangüíneo de 70 nanogramas e dois microlitros de amplicon de PCR recombinante linear aos tubos einor em um bloco de 96 poços e pré-guerra a 37 graus Celsius. Transfira 330 microlitros da cultura SK 36 incubada por três horas em cada tubo. Substitua o DNA por água estéril duplamente destilada como controle.

Incube os tubos a 37 graus Celsius por uma hora após a incubação. Coloque o bloco no gelo, espalhe 100 microlitros de cada transformação em placas de infusão cérebro-coração ou ágar BHI com 500 microgramas por mililitro de micina, incube as placas a 37 graus Celsius por dois dias sob condições microaeróbicas para cada mutante de substituição, pegue aleatoriamente duas colônias individuais e inocule cada colônia em cinco mililitros de BHI contendo 500 microgramas por mililitro de cany. Incubar cada inóculo durante a noite a 37 graus Celsius em condições microanaeróbicas.

Criopreserve cada cultura em 30% de glicerol a menos 80 graus Celsius. Examinar se o mutante contém a substituição esperada do gene. Realize PCR de colônia para cada mutante usando F1 e R três primers em uma placa de PCR de 96 poços.

Use cerca de um microlitro de cultura noturna de cada colônia individual como molde de DNA em uma reação de amplificação de PCR de 25 microlitros. Prossiga para realizar a amplificação de PCR para confirmar a substituição do gene mutante para identificar com precisão mutantes de banda dupla ou amplicon de PCR contaminante. Examine o amplicon de PCR por eletroforese em gel por quatro horas em um comprimento superior a 12 centímetros.

2% AROS gel com coloração de brometo de th sob esta condição de eletroforese em gel Agros. Quaisquer amplicons com diferença maior ou igual a 100 pares de bases podem ser claramente identificados. Alternativamente, quando se prevê que as bandas resultantes da amplificação do de resistência à canamicina e do gene do tipo selvagem difiram em menos de 100 pares de bases, use um primer T um interno do gene alvo para determinar se um gene do tipo selvagem pode ser detectado por PCR.

Para confirmar ainda mais a deleção, purifique os amplicons pelo kit de purificação de PCR 96 de link puro e seqüenciar usando o primer P one, que se liga ao de resistência à canamicina, mantenha apenas os mutantes corretos confirmados por sequenciamento após amplificação por PCR usando os primers F1 e R um para a sequência a montante e F três e R três para a sequência a jusante. Aproximadamente uma quilobase a montante e a jusante de cada gene sangüíneo foram obtidos em 96. Formato de poço sob as condições de PCR e usando os primers projetados.

Um produto específico foi amplificado a partir do DNA genômico sangüíneo em cada reação de PCR, o que indicou que os primers eram altamente específicos para os alvos de s sanguíneo por meio de reamplificação por PCR usando os primers F1 e R três e três amplicons como modelos de DNA. Construções de PCR recombinante linear foram criadas com alto rendimento. Em uma placa de 96 poços composta por uma região a montante de cada gene alvo, um de cana e uma região a jusante de cada gene alvo nessa ordem, as construções de PCR recombinante foram então transformadas em SK 36 sanguíneo e selecionadas por cana em placas de ágar BHI.

Para a maioria das transformações, mais de 1000 colônias foram obtidas em cada placa após uma incubação microaeróbica de dois dias. Quando essas colônias foram amplificadas por PCR usando F1 e R três, uma única banda de DNA correspondente ao tamanho mutante esperado foi observada por eletroforese em gel ao tentar excluir genes essenciais em potencial. Nenhuma colônia deve ser obtida na maioria das transformações para deleção de alguns genes essenciais.

No entanto, as colônias ainda foram obtidas após a transformação após a amplificação por PCR dessas colônias usando F1 e R três bandas 2D NA correspondentes ao tamanho mutante esperado e o tamanho do tipo selvagem apareceu conforme revelado por eletroforese em gel. Para alguns mutantes, o tamanho mutante esperado e o tamanho do tipo selvagem do amplicon de PCR eram muito próximos para serem separados por gel agros longo. Neste caso, um primer T um interno do gene alvo foi projetado com base na sequência do gene do tipo selvagem.

A PCR foi realizada usando o primer interno T one e o primer F1. O tipo selvagem SK 36 foi usado como uma cepa de controle positivo para esta PCR. Se uma banda com o tamanho esperado fosse amplificada a partir do mutante usando o primer interno, o gene era identificado como um gene essencial.

Uma vez que a presença de de micina no mutante foi confirmada anteriormente por sequenciamento de DNA usando o primer P one. Com base neste protocolo, foram coletados 2048 mutantes não essenciais do gene S sangüíneo. Excluindo os quatro quadros de leitura abertos contidos inteiramente em outros quadros de leitura abertos.

218 genes, essenciais para a sobrevivência sanguínea, foram identificados nas condições experimentais. Depois de assistir a esses vídeos, acho que você deve ter uma boa compreensão de como tornar o genoma amplo. Os íons gênicos usam PCR de alto rendimento.