Name: 生細胞中のタンパク質凝集の4Dイメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-05T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: 学ぶ 生細胞中のタンパク質凝集の4Dイメージング法。Ubc9 tsフォールディングセンサーを用いて、ミスフォールディングタンパク質の動態とプロテオスタシス機構を可視化し、細胞内の品質管理プロセスを詳細に解析する手法です。

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1。酵母の準備<ol><li> GAL1-GFP Y68L（UBC9 ts）のカセットを有するプラスミドで酵母株を形質転換する。 </li><li> 16時間またはO / Nのために24時間、2％のラフィノースを含む合成培地で酵母を育て、背中2パーセントガラクトース含有培地に希釈200rpmで振とうしながら30℃で細胞をインキュベートします。 </li><li>翌朝、OD 600 = 0.2にクエリひずみを薄める。文化は= 0.8から1.0のOD 600に到達するまで30℃（200 rpm）で4から6時間振とうする。 </li><li>変更メディアイメージングの前に2％グルコース（SD）の30分を補った合成培地に、（ようにのみ、GFP-Ubc9 tsの翻訳済みと折り畳まプールを監視するために）発現を抑制する。 </li><li>治療 - ヒートショックを37℃で20分間細胞℃のミスフォールディングを誘導する、あるいは連続的に熱ショック条件下でタンパク質凝集を追跡する顕微鏡インキュベーターインチ注 - あなたは、RT上の任意の温度で顕微鏡を使用している場合は、予熱FO（下記参照）顕微鏡や目標の体に沿って温度を平衡化するために2時間ほどR。 </li></ol> 2。プレート\スライドの準備<ol><li>適切な板を選択してください。主な考慮事項は、画像取得時にフォーカスを維持する能力である。以下の点は、2D時間経過または3Dイメージングのための4Dイメージングのために重要とされません。 <ol><li>複数のウェルプレートの異なるウェルの底部（ すなわち、井戸は客観に対して異なる高さになります）均質でないかもしれません。これは、それが困難にかかわらず使用されているオートフォーカス技術の、XYポイントと時間ポイント間のフォーカスを維持するようになります。 </li><li>スライド材質：ガラス対プラスチック。ガラス底のスライドはよりz軸均質ウェル間であるが、より高価である。 </li><li>プレートの底部の厚さ：私たちは通常、カバースリップ底プレート指数1.5を使用していますが、インデックス1は、目的に応じても構わない。 </li></ol></li><li> COV10分間のConA（0.25 mg / ml）を有する板のER底が\スライド。 ConAでは、経時的に、単一のセルに続く可能スライドに細胞を接着させるために使用されています。 </li><li> ConAをを削除し、その過剰のConAが蒸発できるようになるので、化学フードでスライドをインキュベートする。 </li><li>よくConAedに酵母サンプルのプレートを200μl（OD 600 = 0.5）。 </li><li>細胞がプレートの表面に付着し有効にすると、15分間インキュベートする。 </li><li>媒体を抽出し、細胞の1つの層を得るために新しい培地で3回洗浄する。注意：長い時間の経過が計画されている場合、種子は、細胞がまばらに、新しい芽が記入し、関心領域を中断しないこと。 </li></ol> 3。顕微鏡の準備<ol><li>我々はいくつかの非標準的な修正を加えてニコンA1Rsi共焦点顕微鏡を使用しています。酵母イメージングのために、我々は4レーザー（; 457から514 nmであり、65 mWのアルゴンイオンレーザー、561 nmの、50mWのサファイアレーザー、405 nmの、50mWのCUBEのレーザー波長は640nm、40 mWのCUBEレーザー）まで使用すると、最大を装備した4光電子増倍管フィルター。私たちの撮影のほとんどは、EGFPの緑色フィルタセットとmCherryとtdTomato用赤フィルターセットを用いて行われる。 GFPとmCherryとそこにほとんどないbleedthroughはありませんが、そのためには、多くの場合、同時スキャンを使用。しかし、ラインスキャンはまた、それが発生したときにbleedthroughを防止するために使用することができます。私たちの焦点も毎秒2月3日Z-スタック（30-50節）を有効に、zに3ミリ秒のステップを行うことができますPInanoピエゾステージ（MCL）は、装備されています。ガルバノスキャナとレゾナントスキャナー - システムはまた、スペクトル検出器、パーフェクトフォーカス（レーザーオフセット）、および2つのスキャナを持っています。 </li><li>適切な目標を選択してください。主な検討事項： <ol><li>水/油/空気目的：主な考慮事項は、サンプルの媒体対イメージング媒体の屈折率である。 <ol><li>油浸対物の利点： <ol><li>油の目標は、より高い開口数（オイル改水よりも軽いため、より客観的な光子に戻って）を持つことができます。オイル目標は持つことができますNAは1.49、水の1.27と比較しています。 （ただし、これは実際には解像度に大きな違いはありません）。 </li><li>オイルの屈折率はガラスの屈折率に一致し、したがって全く光子が目標に、ガラス越しに、サンプルから行く失われることはありません。 （注 - あなたの目的とあなたのカバースリップのための適切な屈折率を有する液浸油を選んだ）。 </li><li>それが蒸発しないので、オイルは手間のかからない長い時間が経過するようになります。 </li></ol>油浸対物の短所： <ol><li>光が水性媒体（細胞など）を通過しなければならない場合、油の目標の高NA化では有効になって解像度が高くなるほど、急速に低下します。 </li><li>画像は通常、より球面収差を持っており、3Dの効果 &quot;を伸ばして&quot;。 </li><li>オイルはきたない、貼り付けられ、目標に危険。 </li></ol></li><li>水客観的利点<ol><li>セル自体は水性である、従ってzにおける少ない歪みがあるND解像度は水性試料に高深く残っています。 </li><li>クリーンかつユーザーフレンドリー。水客観的短所：客観的に連続的に水を汲み上げるために行われている特別な準備なしで長い映画のために迅速に、それに適していない蒸発する。 </li></ol></li><li>エア客観的利点：1。材料は、複数のポイント取得や長いムービーの途中で/蒸発し消失しません。 2。クリーンかつユーザーフレンドリー。デメリット：低解像度、低信号感度。 </li></ol></li><li>ルームやインキュベーター温度：温度変化は物質の性質に影響を与え、繊細なシステムにフォーカスを変更します。温度は、買収のためのポイントを選択する前に調整する必要があります。買収時の温度を変更すると、画像が中断され、フォーカスが失われます。私たちは、顕微鏡システムは、撮像前に所望の温度で2時間平衡化することができます。 </li><li>補正カラー：多くの目標が有効に補正リングが付属してい目的は、与えられたカバースリップの厚さに合わせて調整することができます。我々は、点広がり関数を可視化する蛍光ビーズを使用しながら、補正環を調整することをお勧めします。これは、すべてのサンプルのための正しい設定を確実にするでしょう。 </li><li>安定したサンプルホルダー：我々は市販されているほとんどのサンプルホルダーは、顕微鏡の最も弱い部分であることがわかる。彼らは頻繁にグラグラとストレートではありません。これは高解像度、マルチポイント4Dイメージングのための災害です。我々はまっすぐである私たち自身のサンプルホルダを設計し、ステージ上にしっかりとフィット。必要なときに彼らはまたダウンしてボルトで固定することができます。 </li><li>マルチポイント集録：私たちの撮像システムは、基本的には、レーザーベースのオートフォーカス機構であるニコン &quot;パーフェクトフォーカス&quot;システムが装備されている。しかし、オートフォーカスシステムは多くのことをドリフトしない場合は特に、4Dイメージングとは必ずしも必要ではありません。 </li></ol></li></ol> 4。イメージング<ol><li>システムの電源をオンにします：レーザー、ステージ、コントローラ、カメラとコンピューター側TERソフトウェア。 </li><li>ステージホルダーの上に置いてプレート、適切に固定され、安定した。 </li><li>酵母の位置と向きを決定するために、目のポートを使用します。 </li><li>明を使用して、形状や質感に応じて細胞の健康と生存率を評価します。 </li><li>関連するフルオロフォア（ 例えば GFPのFITCフィルター）によると落射蛍光ライトをオンにして、自分の研究の対象となる表現型を示す細胞に焦点を当てています。複数の波長で高い蛍光性である細胞が死んだので、自家かもしれません。我々は、SV40 NLSシグナル（NLS-TFP）に融合tdTomatoの蛍光色素で核を可視化する。 TFPは倍GFPのサイズであり、核の拡散限界を上回ることである、したがって、それは核マーカーとして非常にうまく機能します。また、GFPと同時に緑色（488 nm）のレーザーでTFPを励起するが、スペクトル分解能のために2つの別々の光電子増倍管に緑と赤の排出量を収集することができます。 </li><li>ノイズを最小限に抑えるため、以下の設定を調整すると過飽和： <ol><li>レーザパワー - 画像の退色と光毒性対明るさを考慮すべきである。 </li><li>ゲイン：カメラの感度に影響を与え、従って、信号対雑音比。 </li><li>ピンホール径は - 短い波長のレーザーに合わせて調整してください。ピンホールの直径は、光学部の厚さ（高さ）が結像されるかを決定します。このように、ピンホールを開くと（より多くの光子のlet）より多くの光を収集しますが、Z（少ない共焦点）で解像度が低下します。 </li></ol></li><li>便利なヒント： <ol><li>異なる蛍光が合同波長を放出した場合、仮想フィルタの選択を可能にするスペクトル検出機能を使用します。スペクトル検出器は定期的な光電子増倍管よりも感度が低いことに留意してください。 </li><li>異なる蛍光体は、同じレーザーによって励起されている場合は、ラインスキャン機能を使用します。 </li><li>ガルバノスキャナはもっと感度が可能となりますが、退色のための高いリスクを持っています。レゾナントスキャナは速い可能cquisition、こうして退色のリスクを低下させるが、あまり敏感である。 </li><li> 2〜16枚の画像を平均化すること、それは、信号対雑音比が向上しますが、取得が遅くなりますと、もちろん、レーザーへの試料のより多くの露出を伴う。 </li><li>の時間生物学的な問題（ 例えば JUNQとiPodの形成が〜2時間かかります）での買収は、異なります。我々は、最大30時間までの時間経過を3Dでの共振スキャナで画像化された酵母を持っています。 </li><li>タイムラプスインターバル·短い間隔はより一貫性のムービーを作成しますが、退色の原因となるので、信号の損失可能性があります。 </li></ol></li></ol>

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</ol>

特別な利害関係は宣言されません。

生化学的プロセスについての我々の直感は、反応物と生成物のよく混合溶液をビーカーに平衡に到達することを許可されているベンチトップの実験から派生しています。このような設定では、与えられた化学種の濃度は、巨視的なボリュームへの分子のモル量の比であり、単一の番号、のように表すことができる。細胞の全集団のホモジネートからの抽出で行っウェスタンブロット、遠心分離し、分光光度計：はるかに我々はタンパク質の構造と機能について知っているのは、古典的な、バルク反応像を反映するメソッドを使用してから派生しています。 我々は倍率で細胞を見てするために使用する技術として飛躍的に向上し、それはほとんどの生化学反応が生体内で行われる条件は、古典的なベンチトップのシナリオのものにのみわずかな似ても似つかないことをこれまでより明確になります。セルの内部だけではありませんラが密集クラウディング効果が実質的に種々の反応の活性を変化させている環境を、パックされた、それはまた、よく混合の全く逆です。 in vitroおよび複雑な高分子反応の広い範囲の in vivo効率の間の頻繁な格差を占めています。 どこにも、in vivoでのフォールディング、ミスフォールディング、タンパク質の凝集においてに関する質問のようにミスリードしやすい試験管内の生化学的実験では古典から生じる直感はありません。バルク反応におけるタンパク質化学の研究は単純なyesまたはnoの質問のように与えられたタンパク質の折り畳みの問題を扱うことができるのに対し、生細胞内の高分子の全体の集団のダイナミクスを追跡しようとすると、可能性の全体の分布に敏感でなければなりませんポリペプチド鎖のコンフォメーションが利用できる成果、ミスフォールディングと凝集の危険性に関するものである。たとえば、我々はバルクセルLyを調べるかもしれませんウェスタンブロッティングによりタンパク質の凝集を十分に満足させると、タンパク質はほとんど不溶性とユビキチン化ではないと判断。しかし、多くのセルを上に平均化したことを検出するのが難しい、蛋白質の亜集団離散生きている細胞では、水溶性と種の局所濃度が非常に高い特定の区画内にユビキチン化されることがあります。後者のシナリオでは、容量の大きいバルク·サブ集団よりも細胞の生存のためのより多くの重要な結果をもたらす可能性があります。シャペロンは、多面的な行動や、in vitroで種々の機能を表示するのに対し、さらに、それが細胞内でそれらの離散関数が空間的にも時間的に限られていることが明らかになってきています。 生化学を理解するための新興パラダイムでは、濃度は、細胞内の特定のナノ環境変数のプロパティとなり、生物学的プロセスの根底にある分子のイベントは時間ではなく、SPACだけでなく、測定しなければならない電子。それは他の生物学的プロセスと、それらがどのように空間、時間、環境条件が次のように変更に規制されている任意の数を研究するために使用することができますが、ここで提示4Dイメージングのアプローチは、生細胞内でタンパク質の誤った折り畳みの敏感なモデリングを可能にします。本稿では、効果的に細胞質内タンパク質凝集の発生に対処するためのステージとオプションを示していUbc9 TSフォールディングセンサーを使用しています。集約品質管理の細胞生物学を示すことに加えて、このアプローチは、proteostasis（例えばUbc9 tsは酸化に応じてタンパク質の折り畳みストレスを測定するために使用することができます上の特定の摂動または遺伝的変異の効果を解読するための強力なツールとして使用できます品質管理経路の毒性凝集体、または突然変異の発現）。 4Dイメージングは​​、正確に二つの異なるタンパク質間のタンパク質の局在や局在を決定するためにも不可欠であるsであり、多分一時的な現象だが重要なことを検出する。例えば、特に酵母などの小さな球状の生物では、4Dイメージングは​​、これは単に検査の角度のアーティファクトであることを明らかにするかもしれない一方で、構造や集約がjuxtanuclear局在を持っているケースのように見えることがあります。 ここで、本実施例の実験では、細胞質ゾルにおける時間と空間を介して集約品質管理に従うようにタンパク質、Ubc9 tsを 、ミスフォールモデルの使用例を示します。許容温度で、Ubc9 tsは折り畳まれており、核と細胞質内に拡散。熱によるミスフォールディングの際には、最初にプロテアソームによる分解のために処理され、急速に拡散する小さな集合ストレス病巣を形成している。プロテアソームは、部分的に阻害されている場合、これらのストレス病巣は約2時間のコースでJUNQとiPod包有に変換されます。ユビキチン介在性分解は、品質制御オプション、UBとして利用できない場合c9のtsは直ちに保護集約のためのiPodインクルージョンに再ルーティングされます。これらのツールは、集約の品質管理に関与する新規な遺伝因子を発見すると、セル内の空間的·時間的規制を探索する信じられないほどの機会を提供しています。

<table><tbody><tr><td>MG132</td><td>Mercury</td><td>mbs474790</td><td></td></tr><tr><td>con A</td><td>Sigma</td><td>C2010</td><td></td></tr><tr><td>ガラス底板</td><td>同上</td><td>ibd81158</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">4D Fluorescence Imaging of Protein Aggregation Confocal 3D動画は、PInano Piezoステージ(MCL)を搭載したNikon A1R-si顕微鏡を使用し、60倍水対物レンズNA 1.27、0.3ミクロンスライスを使用して取得しました。、0.5 % のレーザー出力 (65 mW 488 レーザーと 50 mW 561 レーザーから)。z-stacksは、5分ごとに90分間取得されました。各zシリーズは、0.5ミクロンのステップサイズと合計30ステップで集録されました。画像処理はNIS-Elementsソフトウェアを用いて行いました。</td></tr></tbody></table>

生細胞中のタンパク質凝集の4dイメージング

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

刻々と変化する環境条件や、密集し粘着性があり、タンパク質の安定性に有害な細胞内環境に直面しても、新たに合成されたタンパク質の適切な折り畳みを維持することは、重要な課題の一つです。タンパク質の生産、フォールディング、分解のバランスをダイナミックにバランスさせる能力には、高度に専門化された品質管理機械が必要であり、その絶対的な必要性は、それが誤動作したときに最もよく観察されます。ALS、アルツハイマー病、パーキンソン病、および特定の形態の嚢胞性線維症などの疾患は、タンパク質フォールディング品質管理コンポーネント2に直接関連しているため、将来の治療法開発には、その根底にあるプロセスの基本的な理解が必要です。私たちの実験課題は、細胞がどのように損傷シグナルを統合し、多様な状況に合わせた応答をマウントするかを理解することです。
タンパク質のミスフォールディングが細胞に対する実存的な脅威となる主な理由は、誤ってフォールディングされたタンパク質が凝集する傾向であり、その結果、混雑した繊細な細胞内フォールディング環境1の世界的な摂動を引き起こします。細胞プロテオームの折り畳み式の健康、すなわち「プロテオースタシス」は、老化、ストレス、酸化的損傷の強要の下でも、精巧な品質管理システム3,4における異なる機構単位の協調的な作用によって維持される。分子シャペロンの特殊な機構は、非天然ポリペプチドに結合し、それらの天然状態への折り畳みを促進することができる1、ユビキチン-プロテアソーム系5による分解を標的とするか、またはそれらを保護凝集封入体6-9に導くことができる。
真核生物では、細胞質凝集品質管理負荷は、傍核品質管理コンパートメント(JUNQ)と不溶性タンパク質沈着物(IPOD)の2つのコンパートメント8〜10に分割されています(図1-モデル)。タンパク質フォールディング品質管理装置によってユビキチン化されたタンパク質は、JUNQに送達され、そこでプロテアソームによる分解のために処理されます。ユビキチン化されていない誤って折りたたまれたタンパク質はIPODに転用され、そこで保護コンパートメントに積極的に凝集します。
この時点まで、生細胞蛍光顕微鏡の方法論的パラダイムは、主にタンパク質を標識し、特定の時点における細胞内のそれらの位置を、通常は2次元で追跡することでした。新しい技術により、実験者は生細胞のサブミクロンスケールにこれまでにないアクセスを得ることができるようになり、サイトゾルの動的構造は、実験的特性評価の挑戦的な新境地として注目されるようになりました。酵母サイトゾル中の複数の蛍光標識タンパク質の3D空間分布を経時的に迅速に監視する方法を紹介します。3Dタイムラプス(4Dイメージング)は、単なる技術的な課題ではありません。むしろ、細胞構造の解析に使用される概念的枠組みの劇的な変化も促進します。
私たちは、生きた酵母の細胞質フォールディングセンサータンパク質を利用して、細胞凝集の品質管理において、迅速な4D蛍光イメージングを使用して、誤ってフォールディングされたタンパク質の明確な運命を視覚化します。Ubc9タンパク質10-12(Ubc9ts)の温度感受性変異体は、細胞のプロテオスタシスのセンサーとしても、凝集の品質管理を追跡するための生理学的モデルとしても非常に効果的です。ほとんどのtsタンパク質と同様に、Ubc9tsは、活性細胞シャペロンにより、許容温度で完全に折りたたまれ、機能します。30°C以上で、または細胞がミスフォールディングストレスに直面した場合、Ubc9tsはミスフォールドし、突然変異、熱変性、または酸化的損傷によってミスフォールドされた天然球状タンパク質の運命に従います。GFPや他の蛍光色素に融合させることで、ストレス病巣を形成したり、JUNQやIPODに向けられたりする際に、3Dで追跡することができます。

<html><img alt="図1" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50083/50083fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50083/50083fig1.jpg" /> 図1。 。品質管理機構が異なる機能を持つ異なるコンパートメントにミスフォールドタンパク質を指示ミスフォールドタンパク質の細胞内区画化：モデル可溶性タンパク質、分解の標的ポリユビキチン化を受け、 チュXTA-N uclear のQ uality制御コンパートメント（JUNQに送信されます）。ユビキチン化することができない不溶性のタンパク質は、それらがアクティブな集約を受ける液胞に隣接私 nsoluble PR otein D eposit（IPOD）に保護隔離のために送信されます。 es.jpgは &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/50083/50083fig2.jpg &quot;/&gt; 図2。 GFP-Ubc9 TSとモデリング、タンパク質のミスフォールディング 。 通常の条件下では、GFP-Ubc9 TS（緑）がネイティブに折り畳まれており、核と細胞質にびまんローカライズされています。核は、NLS-TFP（赤）で標識されている。 Ubc9 TSの発現は全ての実験において、イメージングの前に2％グルコースを添加することによって遮断された。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50083/50083fig2large.jpg" target="_blank">拡大図を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <ol><li> 37〜温度変化に応じ℃、GFP-Ubc9 TS（緑）がミスフォールドおよびサイトゾルストレス病巣を形成している。核は、NLS-TFP（赤）で標識されている。 </li><li> 23℃の熱ショックからの回復時には、熱的に変性させたGFP-Ubc9 TSは減少蛍光レベルによって示されるように、劣化している。 </li><li> 37℃および80 mm MG132でプロテアソーム阻害、GFP-Uへの温度変化に応じて<html> BC9 tsは JUNQとiPod包有物にミスフォールドされ、処理されます。核は、NLS-TFP（赤）で標識されている。 </li><li> 37〜温度シフト℃、ユビキチン化阻害すると、GFP-Ubc9 tsは IPODのインクルージョンにミスフォールドされ、処理されます。核は、NLS-TFP（赤）で標識されている。ユビキチンプロテアーゼ4（Ubp4）はUbc9 tsのユビキチン化をブロックするために過剰発現している。 </li></ol><img alt="図3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50083/50083fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50083/50083fig3.jpg" /> 図3。 JUNQとiPod形成の時間経過図 37に温度シフト80mmのMG132で°Cおよびプロテアソーム阻害すると、GFP-Ubc9 tsのストレス病巣はJUNQとiPod包有物に加工される。核は、NLS-TFP（赤）で標識されている。 3D映像は4分間隔で取得した。 （また、 ムービー1を参照）。com/files/ftp_upload/50083/50083fig3large.jpg &quot;ターゲット=&quot; _blank &quot;&gt;拡大図を表示するには、ここをクリックしてください。

細胞の生存率は、タンパク質のミスフォールディングのタイムリーかつ効率的な管理に依存します。包有物中のフォールディング、劣化、または隔離：ここでは、ミスフォールドタンパク質の異なる潜在的運命を可視化するための方法を説明します。我々はUbc9、折り畳みセンサーの使用方法を示してい<sup&gt; TS</sup&gt;、監視proteostasisと4D顕微鏡を用いた生細胞における凝集の品質管理のため。

生細胞中のタンパク質凝集の4Dイメージング

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

この実験システムは、生細胞内の高解像度3D蛍光画像を取得し、タンパク質フォールディング品質管理の時空間ダイナミクスを監視およびアッセイします。まず、急速に移動するタンパク質複合体を研究するために細胞を準備します。高Z解像度で画像のZスタックを取得します。次にザックスで構成される時系列を取得し、結果の画像を3Dムービーでレンダリングして、結果の画像を分析します。最終的に、4Dイメージングは、さまざまな条件で細胞内の動的および一過性現象を追跡することを可能にします。広視野顕微鏡やタイムラプスなどの既存の方法と比較した場合の4Dイメージングの主な利点は、細胞内のタンパク質の全集団のダイナミクスと空間的時間分布を高解像度で同時に視覚化できることです。この方法は、タンパク質の凝集、品質管理、およびタンパク質のフォールディングに関する細胞生物学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。これらは非常に動的で一時的なプロセスです。したがって、高い時間的および空間的解像度がなければ、それらの多くは観察不可能です。この手法により、アグリゲーションの品質管理に関する洞察を得ることができます。また、タンパク質の相互作用とダイナミクスの研究に革命をもたらす可能性もあります。一般に、この方法に不慣れな個人は、内因的にタグ付けされたタンパク質または低発現タンパク質の3Dムービーを撮影するにはシステムの安定性が必要であるため、苦労するでしょう。高感度・低光退色 UBC nineの温度感受性変異体のように、細胞質フォールディングセンサータンパク質に結合したFluorの融合タンパク質の発現プラスミドで酵母株を形質転換します。2%ラフィノースを含む合成培地で酵母を24時間増殖させ、その後、2%ガラクトース含有培地に希釈し、クエリ株を約0.2のOD 600に一晩希釈し、イメージングの30分前に0.8〜1.0のOD 600に達するまで4〜6時間培養しますイメージングの30分前に。2%グルコースを添加した合成培地で発現を抑制します。このステップでは、発現タンパク質のすでに翻訳およびフォールディングされたプールのみをモニタリングできます。次に、摂氏37度で細胞に20分間熱衝撃を与えます。ミスフォールディングを誘発するには、4回のD.Imaging撮影中にピントを維持するための適切なプレートを選択します。プレートの底を0.25ミリグラム/ミリリットルのcon Aで10分間覆います。Con Aは、細胞をスライドに接着するために使用され、これにより、単一の細胞を経時的に追跡することができます。con Aとarrowを吸引し、ケミカルフードでプレートを乾燥させます。次に、200マイクロリットルの酵母サンプルを追加します。15分間インキュベートして、細胞がプレートに接着できるようにします。培地で3回の洗浄を行い、酵母イメージング用の細胞の単層を得ます。共焦点顕微鏡は、添付のテキストで詳しく説明されているように、いくつかの非標準的な変更を加えて使用してください。この酵母イメージングシステムは、最大4つのレーザーとフィルターを備えた最大4つの光増倍管を使用します。私たちのイメージングのほとんどは、EGFP用の緑色フィルターセットと、mチェリーとTDトマト用の赤色フィルターセットで行われています。また、共焦点にpi nano pizoステージパーフェクトフォーカスシステムを装備し、ガルバンOスキャナーとレゾナントスキャナーの両方が目的の温度に達するまで顕微鏡システムを平衡化します。イメージング媒体とサンプルの媒体の屈折率に基づいてイメージングする前に、適切な対物レンズの水、油、または空気を選択します。プレートの厚さに応じて修正カラーを調整します。レンズワイプとエタノールを使用して対物レンズを清掃します。また、サンプルを運んでいるスライドを清掃します。プレートをステージホルダーにしっかりと置き、サンプルホルダーの安定性を確認して、すべてのサンプルに正しい設定があることを確認します。蛍光ビーズを使用しながら補正環を調整し、アイポートでの点像拡げ機能を可視化します。酵母の位置と向きを決定します。次に、必要な蛍光灯のエピライトをオンにし、関連する表現型を示す細胞に焦点を合わせます。次に、明視野を使用して、細胞の生存率を評価するための形状とテクスチャに従って細胞の健康と生存率を評価します。TD トマトフローラ Fluor を SV 40 および LS シグナルに融合させて核を可視化します。TFPはGFPの2倍の大きさです。核の拡散限界を超えているため、核マーカーとして非常にうまく機能します。GFPと同時に緑色の4 88ナノメートルレーザーでTFPを励起しますが、スペクトル分解能のために緑と赤の放射を2つの別々のPMTに収集します。ノイズと飽和を最小限に抑えるには、付属の原稿に詳述されているように、レーザー出力とピンホールの直径を調整します。異なるフローラ力が合同波長を放出する場合、仮想フィルターの選択を可能にするスペクトル検出器機能を使用して、実験デザインに従ってタイムラプス画像を取得し、ミスフォールドタンパク質U BBC nine Tsは、時間と空間にわたる凝集品質管理を追跡するためのモデルシステムを提供します。許容温度のサイトゾルでは、UBC nine Tsは、熱によるミスフォールディングにより、核とサイトゾルで折り畳まれて拡散します。それは最初に、プロテアソーム分解のために処理される急速に拡散する小さな細胞質凝集体涙点を形成します。プロテアソームが部分的に阻害されると、これらのプンクタは約2時間かけてジャンク品やiPodのインクルージョンに変換されます。通常の条件下では、GFP UBC nine Tsは天然に折り畳まれており、この緑色で見られるように、細胞質核内でびまん性に局在しています。温度が摂氏37度に変化すると、融合タンパク質は誤って折り畳まれ、摂氏23度の熱ショックから回復すると細胞質涙点凝集体を形成します。熱変性したG-F-P-U-B-C nine Tsは、蛍光レベルの低下によって示されるように劣化します。原子核はN-L-S-T-F-Pで赤くラベル付けされています。摂氏37度への温度シフトがプロテアソーム阻害と組み合わされると、G-F-P-U-B-Cの9つのTは誤って折りたたまれ、ジャンクとiPodのインクルージョンに処理されます。ここでは、ユビキチンプロテアーゼ4が過剰発現してユビキチン化を阻害し、ユビキチン化の阻害を阻害するとともに、温度シフトの結果、G-F-P-U-B-C nine TsがiPod Inclusionに処理される。4分間隔で撮影されたこれらのタイムラプス画像は、ジャンクとiPodの形成のダイナミクスをはっきりと描いています。この手法は、UBC nine Tsをフォールディングセンサーとして使用することにより、細胞のタンパク質スタシスを経時的に監視するために使用できます。4Dイメージングは、哺乳類細胞やC Eleganceなどの他のモデルシステムでも行うことができます。また、4Dイメージングでは、可溶性凝集体ストレス病巣の形成とダイナミクス、ジャンクやiPodコンパートメントへの凝集体の送達など、凝集品質管理における他の微妙なイベントについての洞察も可能になります。

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生物学

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遺伝子組み換えショウジョウバエの脳におけるタンパク質凝集体のイメージングと定量

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4次元蛍光イメージングと住んでいる神経末端におけるエンドソームダイナミクスの可視化

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酵母の4D顕微鏡検査

ここでは、蛍光相関分光法を用いて、細胞ライセートおよび生細胞におけるタンパク質オリゴマーおよび凝集を測定する手順を紹介する。...

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Caenorhabditisエレガンスにおける自動包接計数を用いた生体内のタンパク質凝集動態のモニタリング

このプロトコルでは、従来のGFP/mCherryタグアプローチでは検出が困難な少量のタンパク質や翻訳後修飾のライブイメージングを可能にするために、カスタマイズされた抗体ベースの蛍光標識とショウ ジョウバエ...

蛍光抗体注入によるショウジョウバエの生きた胚における低存在量タンパク質と翻訳後修飾の可視化

学ぶ 生細胞中のタンパク質凝集の4Dイメージング法。Ubc9 tsフォールディングセンサーを用いて、ミスフォールディングタンパク質の動態とプロテオスタシス機構を可視化し、細胞内の品質管理プロセスを詳細に解析する手法です。

生細胞中のタンパク質凝集の4Dイメージング

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