Fabricação de chips microfluídicos e método para detectar a gripe
March 26th, 2013
Um chip microfluídico integrado termoplástico tem sido desenvolvido para utilização como um diagnóstico molecular. O chip realiza a extracção dos ácidos nucleicos, a transcriptase reversa, e PCR. Os métodos para fabricar e executando o chip encontram-se descritos.
O objetivo geral do experimento a seguir é detectar o vírus influenza A usando um chip microfluídico. Primeiro, execute a amostra com tampão de lise através do canal SPE para analisar o vírus e extrair o RNA, carregue o reagente RTPC com o RNA extraído e execute o canal de transcrição reversa para converter o RNA viral em CDNA. Em seguida, execute a mistura no canal de PCR para amplificar os resultados do DNA obtidos que mostram o tamanho e a concentração do amplicon com base no sinal de fluorescência da eletroforese capilar.
A principal vantagem dessa tecnologia é que ela aceita a amostra bruta do paciente e integra extração de ácido nucleico, purificação, transcrição reversa e amplificação em um único chip Para criar duas placas, distribua aproximadamente nove gramas de pellets XN X uniformemente no centro de uma placa de metal, coloque em uma prensa aquecida a 198 graus Celsius por cinco minutos. Em seguida, aplique pressão lentamente a 2.500 PSI por mais cinco minutos. Agora, posicione uma placa no molde de epóxi pré-aqueça a 157 graus Celsius por 10 minutos e aplique pressão lentamente a 1000 PSI por mais 10 minutos.
Em seguida, usando luvas térmicas, remova a placa e o molde da prensa a quente e, em seguida, remova a placa do molde antes que esfrie. Faça três furos no cavaco em relevo, um na entrada, um na porta de resíduos e um na saída do canal microfluídico. Em seguida, lave os chips com IPA seguido de RNAs e água de dianna.
Seque os chips com ar para unir os chips primeiro, pré-aqueça a 131 graus Celsius por 10 minutos e, em seguida, pressione a 350 PSI por mais 10 minutos. Usando JB Weld Epoxy, conecte as nano portas no resíduo de entrada e as portas de saída curem separadamente por 15 a 24 horas. De acordo com as instruções do fabricante, enxágue o canal SPE com 50 microlitros de RNAs seguidos de 100 microlitros de água livre de nuclease.
Agora carregue o canal SPE com quatro microlitros de solução de enxerto recém-preparada para reticular a incubação de metacrilato por 10 minutos em um forno UV, remova a solução de enxerto residual com vácuo. Quebre o pellet de microesfera seco batendo no tubo com a tampa fechada. Em seguida, adicione 100 microlitros de solução de coluna SPE preparada fresca e vórtice para misturar.
Carregue quatro microlitros da solução de SPE na mesma reticulação do canal por irradiação UV por 2,5 minutos de cada lado, resultando em uma coluna SPE polimerizada branca opaca. Lave o canal com 500 microlitros de metanol a 100% para enxaguar o excesso de reagentes e solventes pirogênicos intrapolímeros. Prenda dois aquecedores de filme fino na parte inferior do chip com fita termicamente condutora.
Observe que as laterais dos aquecedores precisam estar alinhadas com a borda dos canais largos para a duração do Dene e, ajoelhando-se separadamente, coloque cinco termopares no chip através dos canais laterais abertos sem saída de cada fita de chip. Para fixar a localização dos termopares, adicione quatro microlitros de 25 XRNA seguros a 96 microlitros de etanol a 70% em um tubo e a 100% de etanol em um segundo tubo. Além disso, prepare 300 microlitros de tampão de canal e 316 microlitros de tampão de lise.
Aqueça as soluções a 60 graus Celsius por 15 minutos. Para ativar o RNA seguro, então para equilibrar o canal microfluídico. Execute o buffer de canal através do canal SPE a uma taxa de fluxo de 0,8 mililitros por hora.
Agora, amostra de teste rápido de fava em VTM a 37 graus Celsius. Remova a amostra assim que for descongelada. Centrifugar a amostra a 13 000 rpm durante 10 minutos.
Transfira 100 microlitros do sobrenadante para 300 microlitros do tampão de lise e adicione seis microlitros de um micrograma por transportador de microlitro, vórtice de RNA para misturar. Em seguida, gire por cinco segundos e carregue todo o lisado em uma seringa de isca com trava de uma CC. Execute o lisado através do canal SPE a uma taxa de fluxo de 0,8 mililitros por hora.
Em seguida, lave o canal SPE com 100 microlitros de etanol a 70%, seguido de 100 microlitros de etanol a 100% a um mililitro por hora. Posicione uma seringa vazia na marca de 0,5 mililitro e empurre o ar pelo canal para secá-lo a um mililitro por hora. Agora execute 67,5 microlitros de água livre de nuclease através do canal para eluir os ácidos nucléicos ligados a 0,5 mililitros por hora e colete 13,5 microlitros da porta nano na porta de resíduos.
Carregue 36,5 microlitros do mestre RTPCR. Misture a porta nano na porta de resíduos e misture com o RNA modelo para uma reação RTPC de 50 microlitros. Em seguida, coloque a mistura RTPC no canal RT por vácuo suave.
Sele a porta nano com um encaixe fechado. Aplique 35 volts ao aquecedor um. Mantenha os reagentes no canal RT por 30 minutos após o aquecimento um se equilibrar a 50 graus Celsius.
Mantenha os reagentes no canal RT por 15 minutos após o aquecimento um se equilibrar a 95 graus Celsius. Em seguida, aplique 27 volts ao aquecedor um e 50 volts ao aquecedor, dois para equilibrar o aquecedor, um a 60 graus Celsius e o aquecedor dois a 95 graus Celsius. Empurre os reagentes para o canal de PCR a 0,5 microlitros por minuto.
Cerca de 20 minutos depois, quando os reagentes se aproximaram do final do canal serpentino, colete os produtos de PCR na saída usando um pipetador de tamanho apropriado e uma ponta para o teste de DNA de alta sensibilidade da Agilent. Remova o kit de DNA de alta sensibilidade da Agilent da geladeira 30 minutos antes do teste. Ligue o bioanalisador e abra o software especializado 2.100.
Carregue um microlitro dos produtos de PCR para teste e siga o protocolo Agilent. Analise e registre os dados neste fluxo de trabalho. A amostra de faringe nasal do paciente é misturada com tampão de lise e aplicada ao chip.
O chip é executado e os produtos de PCR do vírus influenza são vermelhos usando um chip comercial de eletroforese capilar. Devido às diferentes quantidades de vírus influenza na amostra de cada paciente, a concentração final do produto da PCR varia. Um bom resultado deve ter baixo ruído para limpar picos de escada em 35 e 10, 380 pares de bases e um único pico de produto no tamanho de produto projetado de 107 pares de bases para a amostra positiva.
Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como fabricar e executar o chip de microfluido para detectar o vírus influenza a.
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Visão Geral
Este estudo apresenta um chip termoplástico microfluídico integrado projetado para diagnósticos moleculares, especificamente para detectar o vírus da gripe A. O chip facilita a extração de ácido nucleico, transcrição reversa e amplificação de PCR em um processo simplificado.
Principais Componentes do Estudo
Área da Ciência
- Microfluídica
- Diagnósticos moleculares
- Virologia
Contexto
- Dispositivos microfluídicos têm o potencial de revolucionar processos de diagnóstico.
- Extração e amplificação eficientes de ácido nucleico são cruciais para a detecção viral precisa.
- A integração de múltiplas etapas em um único chip melhora a usabilidade e reduz riscos de contaminação.
- Esta tecnologia permite o uso de amostras brutas de pacientes, simplificando o fluxo de trabalho.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um chip microfluídico que integre extração de ácido nucleico, purificação, transcrição reversa e amplificação.
- Demonstrar a eficácia do chip na detecção do vírus da gripe A.
- Fornecer uma metodologia detalhada para fabricar e operar o chip.
Métodos Utilizados
- Lisi de amostra com um buffer para extrair RNA do vírus.
- Carregamento de reagentes de PCR de transcrição reversa (R-T-P-C-R) com RNA extraído.
- Execução do canal de transcrição reversa para converter RNA viral em cDNA.
- Amplificação do DNA no canal de PCR e análise de resultados via eletroforese capilar.
Principais Resultados
- O chip detecta com sucesso o vírus da gripe A a partir de amostras brutas de pacientes.
- Os resultados indicam o tamanho e a concentração do amplicon com base em sinais de fluorescência.
- A abordagem integrada reduz a necessidade de múltiplos procedimentos separados.
- A análise de fluorescência confirma a eficácia do processo de amplificação.
Conclusões
- O chip microfluídico representa um avanço significativo em diagnósticos moleculares.
- Ele simplifica o processo de detecção do vírus da gripe A.
- Esta tecnologia pode ser adaptada para outros patógenos virais no futuro.
