Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Science Education
Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.

 
Click here for the English version

תקציר אנזימי הגבלה

Overview

הגבלת אנזימים או אנדונוקלאזים מזהים וחותכים דנ"א ברצף מסוים. אנזימים אלה מתרחשים באופן טבעי בחיידקים כהגנה מפני בקטריופאג'ים - וירוסים שמדביקים חיידקים. אנזימי הגבלת חיידקים חותכים את הדנ"א הבקטריופאז' הפולש תוך השארת הדנ"א הגנומי החיידקי ללא פגע עקב תוספת של קבוצות מתיל.

וידאו זה מסביר את העקרונות הבסיסיים של אנזימי הגבלה כולל: כיצד אנזימי הגבלה נקראים וסוגי אתרי זיהוי ו overhangs הקיימים. כמו כן מסופק הליך כללי צעד אחר צעד כיצד להגדיר תקציר הגבלה כולל הרכיבים הדרושים, את הסדר שבו יש להרכיב את התערובת, ואת טמפרטורת הדגירה הטיפוסית וזמן. החשיבות של אימת אנזימי הגבלה למניעת פעילות כוכב מוזכרת. טיפים לביצוע אנזימים מרובים מעכלים ושימוש בבקרות בתגובות עיכול מסופקים גם.

Procedure

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

אנזימי הגבלה, או אנדונוקלאזים מגבילים, משמשים במגוון יישומים שונים בביולוגיה מולקולרית. אנזימים אלה מזהים ומבקעים רצף דנ"א מסוים, הנקרא אתר הגבלה. הסרטון שאתם עומדים לצפות בו מספק מידע רקע על המולקולות המופלאות האלה ומראה כיצד להגדיר תקציר אנזים מוגבל.

מאיפה בכלל מגיעים אנזימי הגבלה? אנזימים אלה הם במקרה הסתגלות של חיידקים הפועלים כמנגנון הגנה מפני וירוסים המכונים בקטריופאג'ים. הודות לתוספת של קבוצות מתיל להגבלת אתרי אנזימים על DNA חיידקי, אנזימי הגבלה מזהים וחותכים רק את ה- DNA של פאג ', ובכך מונעים זיהום.

לאנזימי הגבלה יש שמות די מוזרים. למשל, הינדי, נוטי, אקוארי ובאהי. שלוש האותיות הראשונות של שם אנזים הגבלה מתייחסות לאורגניזם שממנו הוא היה מבודד. לדוגמה, אנזים ההגבלה EcoRI היה מבודד מ E. coli. האות הרביעית, במידת הצורך, מתייחסת לזן החיידקי שממנו בודד האנזים. הספרה הרומית מציינת אם זהו האנזים הראשון, השני, השלישי, המבודד מאותו אורגניזם מסוים.

אנזימי הגבלה מזהים רצף של נוקלאוטידים, בדרך כלל באורך של ארבעה עד שמונה זוגות בסיסים, הנקראים אתר זיהוי. בנוקלאוטידים ספציפיים בתוך הרצף, האנזים ישבור את קשרי הזרחן בעמוד השדרה של הדנ"א. אתרי הזיהוי הם בדרך כלל פלינדרומיים, כלומר הרצף קורא את אותם קדימה ואחורה. כאשר הפלינדרום נמצא על גדילים משלימים של מולקולת DNA זה נקרא פלינדרום הפוך חוזר.

אנזימי הגבלה יכולים להשאיר סוגים שונים של קצוות ברגע שהדנ"א מבקע: קצוות דביקים וקצוות קהים. קצוות דביקים משאירים 3' ו -5 'overhangs בעוד קצוות קהים להשאיר לא overhangs. סוג הקצה מכתיב כיצד שבר הדנ"א המבודד על ידי תקציר אנזים ההגבלה יתאחד מחדש עם שברי דנ"א אחרים בתהליך המכונה קשירה.

תקציר אנזים הגבלה צריך להיות מתוכנן בקפידה. תגובת עיכול מורכבת בדרך כלל מהבאים: מים דה-יונו, הדנ"א שהולך להיחתך, חוצץ ספציפי לאנזים שתשתמשו בו, ולפעמים חלבון שנקרא אלבומין בסרום בקר או BSA. BSA ייצב את התגובה על ידי מניעת אנזים מלהידבק לצד המיכל המאכלס את התקציר. לכל אנזים הגבלה יכולים להיות תנאי חיץ שונים, טמפרטורות דגירה ודרישות עבור BSA. לספקים של אנזימי הגבלה יהיו משאבים שניתן לבדוק כדי להשיג את כל המידע הדרוש.

כדי להתחיל להגדיר את התקציר, יש לאחזר את אנזים ההגבלה מהמקפיא או מהמקרר. שמור את אנזים ההגבלה על קרח או מיכל עמיד תרמי כדי לוודא שיש פעילות אופטימלית לתגובות עתידיות. כדי רכיבי תגובת צינור microfuge יש להוסיף בסדר הבא. ראשית, נפח של מים סטריליים, ללא נוקלאז שיניב נפח תגובה סופי של 20μL. ואז 10x הגבלה אנזים חוצץ, אז BSA במידת הצורך, עד 1μg של DNA, ו 2-10 יחידות של אנזים. יחידות מוגדרות כמות האנזים הנדרש כדי לייצר תקציר מלא של 1μg של DNA שליטה ב 60 דקות ב 37 ° C בנפח תגובה 50μL. לאחר מכן, לערבב על ידי מערבולת ולאחר מכן צנטריפוגה לזמן קצר ב 12,000xg ב microcentrifuge כדי לאסוף את התוכן בתחתית הצינור. לאחר מכן לדגור בטמפרטורה אופטימלית עבור אנזים ההגבלה שלך, בדרך כלל 37°C בבלוק חימום במשך 1 עד 4 שעות.

לאחר שהתקציר שלך הושלם, מומלץ לדגור על תערובת התגובה ב-65 מעלות צלזיוס כדי לחמם את אנזימי ההגבלה. בעוד שאנזימי הגבלה חותכים את האתר באופן ספציפי רוב הזמן, זמני דגירה ממושכים יכולים להוביל לפעילות כוכבים, אשר חיתוך באתרים דומים, אך נבדל מאתרי העיכול הטיפוסיים שלהם.

לאחר אי-הפעלת ה- DNA, יש להפעיל את ה- DNA על ג'ל אגרוז כדי להבטיח כי התקציר היה מוצלח.

הנה כמה רמזים מועילים להפעלת התקצירים שלך ולהבטחת הצלחה.

לפעמים אתה עלול למצוא את עצמך במצב שבו אנזימים מרובים צריכים לשמש כדי ליצור שבר DNA ספציפי. במקרה זה אתה צריך לבדוק כי תנאי חיץ וטמפרטורות הדגירה תואמים בין שני אנזימים, אם כן, אז אתה יכול לבצע תקציר כפול ויש שני אנזימים לחתוך באותה תגובה. עם זאת, לעיתים תמצאו חוסר תאימות בתנאי התגובה בין שני האנזימים, ובמקרה זה הדרך לעקיפת הבעיה היא להשתמש באנזימים ברצף. לדוגמה, התקציר יכול להתבצע עם אנזים אחד תחילה, ולאחר מכן את הרכב המאגר, ניתן לשנות על מנת להיות אופטימלי עבור האנזים השני. דרך נוספת להתגבר על אי התאמה של חיץ ולבצע תקציר רציף היא לטהר את ה- DNA לאחר התקציר הראשוני ולאחר מכן לבצע את התקציר השני.

שימוש בפקדים הוא דרך טובה להבין מדוע תקציר עלול להשתבש. לדוגמה, בקרת אנזימים ללא אנזים תאפשר לך לבדוק את שלמות דגימת ה- DNA ולקבוע אם קיימת פעילות exonuclease. השימוש בדנ"א שליטה באתרי הגבלה ידועים מאפשר לבדוק את פעילות האנזים.

עכשיו שראינו איך תקצירים מתבצעים, מאפשר להסתכל על דרכים שונות הגבלת אנזימים ניתן להשתמש.

ניתן להשתמש באנזימי הגבלה באופן אבחוני, על מנת לזהות דגימות מסוימות. על ידי טעינת תקציר לתוך שבב מיוחד ולאחר מכן הצבת שבב ש לתוך מכונה שנקראת bioanalyzer. חוקרים יכולים לבחון את גודל שבר הדנ"א, המיוצר על ידי התקציר, על מנת לקבוע את האותנטיות של דגימות דגים. דפוסי הפסים השונים של אותו גן ממין נתון, או במקרה זה מינים שונים, נקראים פולימורפיזם באורך שבר הגבלה.

אנזימי הגבלה יכולים לשמש גם בתת-קלוניה כדי לבודד שבר דנ"א מפלסמיד אחד ולהכניס אותו לאחר, כך שניתן יהיה לשכפל את השבר הרצוי באמצעות חיידקים.

על ידי שימוש בתגובת שרשרת הפולימראז, או PCR כדי להכניס אתרי הגבלה לגנים במקומות ספציפיים מאוד, ניתן להשתמש באנזימי הגבלה כדי לקבוע את נוכחותם של הבדלי נוקלאוטיד יחיד בצורות חלופיות של אותו גן, או אלל. אלה פולימורפיזם נוקלאוטיד יחיד, או SNPs, קשה לזהות עם PCR ואלקטרופורזה ג'ל לבד. עם כניסתו של אתר ההגבלה בתוך SNP, תקציר פשוט יכול להבחין בין אללים.

הרגע צפית בסרטון של ג'וב על אנזימי הגבלה. למדתם מאיפה האנזימים האלה מגיעים, לימדו כמה יסודות על איך הם עובדים, ראיתם איך להקים תקציר, ולמדתם כיצד ניתן להשתמש באנזימים מוגבלים בביולוגיה מולקולרית. כמו תמיד, תודה שצפית!

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

לא הוכרזו ניגודי אינטרסים.

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter