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Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

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Digest enzimatico di restrizione

Overview

Gli enzimi di restrizione o le endonucleasi riconoscono e tagliano il DNA in una sequenza specifica. Questi enzimi si trovano naturalmente nei batteri come difesa contro i batteriofagi - virus che infettano i batteri. Gli enzimi di restrizione batterica tagliano il DNA del batteriofago invasore lasciando illeso il DNA genomico batterico a causa dell'aggiunta di gruppi metilici.

Questo video spiega i principi di base degli enzimi di restrizione, tra cui: come vengono denominati gli enzimi di restrizione e i tipi di siti di riconoscimento e sporgenze esistenti. Viene inoltre fornita una procedura generalizzata passo-passo su come impostare un digest di restrizione che includa i componenti necessari, l'ordine in cui la miscela deve essere assemblata e la temperatura e il tempo tipici di incubazione. Viene menzionata l'importanza di inattivare gli enzimi di restrizione per prevenire l'attività delle stelle. Vengono inoltre forniti suggerimenti per l'esecuzione di più digest enzimatici e l'utilizzo di controlli nelle reazioni di digestione.

Procedure

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Gli enzimi di restrizione, o endonucleasi di restrizione, sono utilizzati in una varietà di diverse applicazioni in biologia molecolare. Questi enzimi riconoscono e scissono una specifica sequenza di DNA, chiamata sito di restrizione. Il video che stai per guardare fornisce alcune informazioni di base su queste molecole miracolose e mostra come impostare un digest enzimatico di restrizione.

Da dove vengono comunque gli enzimi di restrizione? Questi enzimi sono un adattamento dei batteri che agiscono come meccanismo di difesa contro i virus noti come batteriofagi. Grazie all'aggiunta di gruppi metilici ai siti degli enzimi di restrizione sul DNA batterico, gli enzimi di restrizione riconoscono e tagliano solo il DNA dei fagi, prevenendo così l'infezione.

Gli enzimi di restrizione hanno alcuni nomi piuttosto strani. Ad esempio, HindIII, NotI, EcoRI e BamHI. Le prime tre lettere di un nome enzimatico di restrizione si riferiscono all'organismo da cui è stato isolato. Ad esempio, l'enzima di restrizione EcoRI è stato isolato da E. coli. La quarta lettera, se necessario, si riferisce al ceppo batterico da cui è stato isolato l'enzima. Il numero romano indica se si tratta del primo, secondo, terzo enzima isolato da quel particolare organismo.

Gli enzimi di restrizione riconoscono una sequenza di nucleotidi, di solito lunga da quattro a otto coppie di basi, chiamata sito di riconoscimento. A specifici nucleotidi all'interno della sequenza, l'enzima romperà i legami fosfodiestere nella spina dorsale del DNA. I siti di riconoscimento sono solitamente palindromi, il che significa che la sequenza legge gli stessi avanti e indietro. Quando il palindromo si trova su filamenti complementari di molecola di DNA, viene chiamato palindromo a ripetizione invertita.

Gli enzimi di restrizione possono lasciare diversi tipi di estremità una volta che il DNA è scisso: estremità appiccicose e estremità smussate. Le estremità appiccicose lasciano sporgenze di 3' e 5' mentre le estremità smussate non lasciano sporgenze. Il tipo di estremità determina come il frammento di DNA isolato dall'enzima di restrizione digest verrà ricombinato con altri frammenti di DNA in un processo noto come legatura.

Un digest enzimatico di restrizione deve essere attentamente pianificato. Una reazione di digestione consiste in genere di quanto segue: acqua deionizzata, il DNA che verrà tagliato, tampone specifico per l'enzima che si utilizzerà e, a volte, una proteina chiamata albumina sierica bovina o BSA. BSA stabilizzerà la reazione impedendo all'enzima di attaccarsi al lato del contenitore che ospita il digest. Ogni enzima di restrizione può potenzialmente avere diverse condizioni tampone, temperature di incubazione e requisiti per BSA. I fornitori di enzimi di restrizione avranno risorse che si possono controllare per ottenere tutte le informazioni necessarie.

Per iniziare a impostare il digest, recuperare l'enzima di restrizione dal congelatore o dal frigorifero. Mantenere l'enzima di restrizione sul ghiaccio o su un contenitore resistente al termico per assicurarsi che vi sia un'attività ottimale per reazioni future. A un microfugo i componenti di reazione del tubo devono essere aggiunti nel seguente ordine. In primo luogo, un volume di acqua sterile e priva di nucleasi che produrrà un volume di reazione finale di 20 μL. Quindi 10x Buffer enzimatico di restrizione, quindi BSA se necessario, fino a 1μg di DNA e 2-10 unità di enzima. Le unità sono definite come la quantità di enzima necessaria per produrre un digest completo di 1μg di DNA di controllo in 60 minuti a 37°C in un volume di reazione di 50μL. Successivamente, mescolare vorticosamente e quindi centrifugare brevemente a 12.000xg in una microcentrifuga per raccogliere il contenuto sul fondo del tubo. Quindi incubare a una temperatura ottimale per l'enzima di restrizione, di solito 37 ° C in un blocco riscaldante per 1 o 4 ore.

Una volta completato il digest, è una buona idea incubare la miscela di reazione a 65 ° C per disattivare termicamente gli enzimi di restrizione. Mentre gli enzimi di restrizione tagliano il sito specifico per la maggior parte del tempo, i tempi di incubazione prolungati possono portare all'attività delle stelle, che sta tagliando in siti simili, ma distinti dai loro tipici siti di digestione.

Dopo l'inattivazione, il DNA deve essere eseguito su un gel di acarosio per garantire che il digest abbia avuto successo.

Ecco un paio di suggerimenti utili per eseguire i tuoi digest e garantire il successo.

A volte potresti trovarti in una situazione in cui è necessario utilizzare più enzimi per generare un frammento di DNA specifico. In questo caso è necessario verificare che le condizioni tampone e le temperature di incubazione siano compatibili tra i due enzimi, in tal caso, è possibile eseguire un doppio digest e far tagliare entrambi gli enzimi nella stessa reazione. A volte, tuttavia, troverai incompatibilità nelle condizioni di reazione tra i due enzimi, e in questo caso la soluzione alternativa è usare gli enzimi in sequenza. Ad esempio, il digest può essere eseguito prima con un enzima, e quindi la composizione del tampone, può essere alterata per essere ottimale per il secondo enzima. Un altro modo per superare l'incompatibilità del buffer ed eseguire un digest sequenziale è quello di purificare il DNA dopo il digest iniziale e quindi eseguire il secondo digest.

L'uso dei controlli è un buon modo per capire perché un digest potrebbe andare storto. Ad esempio, un controllo senza enzimi consentirà di verificare l'integrità del campione di DNA e determinare se è presente attività di esonucleasi. L'uso di DNA di controllo con siti di restrizione noti consente di testare l'attività dell'enzima.

Ora che abbiamo visto come vengono eseguiti i digest, diamo un'occhiata ai vari modi in cui gli enzimi di restrizione possono essere utilizzati.

Gli enzimi di restrizione possono essere utilizzati diagnosticamente, al fine di identificare campioni particolari. Caricando un digest in un chip specializzato e quindi posizionando quel chip in una macchina chiamata bioanalizzatore. I ricercatori possono esaminare le dimensioni dei frammenti di DNA, prodotti dal digest, al fine di determinare l'autenticità dei campioni di pesce. I diversi modelli di banding dello stesso gene di una data specie, o in questo caso di specie diverse, sono chiamati polimorfismi di lunghezza del frammento di restrizione.

Gli enzimi di restrizione possono anche essere utilizzati nella subclonazione per isolare un frammento di DNA da un plasmide e inserirlo in un altro, in modo che il frammento desiderato possa essere replicato utilizzando i batteri.

Impiegando la reazione a catena della polimerasi, o PCR per introdurre siti di restrizione nei geni in luoghi molto specifici, gli enzimi di restrizione possono essere utilizzati per determinare la presenza di differenze di singoli nucleotidi in forme alternative dello stesso gene o allele. Questi polimorfismi a singolo nucleotide, o SNP, sono difficili da rilevare con la sola PCR ed elettroforesi su gel. Con l'introduzione del sito di restrizione all'interno dell'SNP, un semplice digest può distinguere tra gli alleli.

Hai appena visto il video di JoVE sugli enzimi di restrizione. Hai imparato da dove provengono questi enzimi, ti sono state insegnate alcune nozioni di base su come funzionano, hai visto come impostare un digest e hai imparato come gli enzimi di restrizione possono essere utilizzati in biologia molecolare. Come sempre, grazie per aver guardato!

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