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Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

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Clonazione molecolare

Overview

La clonazione molecolare è un insieme di metodi, che vengono utilizzati per inserire DNA ricombinante in un vettore - un vettore di molecole di DNA che replicherà frammenti di DNA ricombinante negli organismi ospiti. Il frammento di DNA, che può essere un gene, può essere isolato da un campione procariotico o eucariotico. Dopo l'isolamento del frammento di interesse, o inserto, sia il vettore che l'inserto devono essere tagliati con enzimi di restrizione e purificati. I pezzi purificati sono uniti insieme attraverso una tecnica chiamata legatura. L'enzima che catalizza la reazione di legatura è noto come ligasi.

Questo video spiega i principali metodi che sono combinati, in tandem, per comprendere la procedura generale di clonazione molecolare. Vengono discussi gli aspetti critici della clonazione molecolare, come la necessità di una strategia di clonazione molecolare e come tenere traccia delle colonie batteriche trasformate. Vengono inoltre menzionate le fasi di verifica, come il controllo del plasmide purificato per la presenza di inserti con digest e sequenziamento delle restrizioni.

Procedure

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La clonazione molecolare è un insieme di tecniche utilizzate per inserire DNA ricombinante da una fonte procariotica o eucariotica in un veicolo replicante come plasmidi o vettori virali. La clonazione si riferisce alla realizzazione di numerose copie di un frammento di DNA di interesse, come un gene. In questo video imparerai a conoscere le diverse fasi della clonazione molecolare, come impostare la procedura e le diverse applicazioni di questa tecnica.

Almeno due importanti molecole di DNA sono necessarie prima che inizi la clonazione. Innanzitutto, e soprattutto, hai bisogno del frammento di DNA che stai per clonare, altrimenti noto come inserto. Può provenire da un procariota, eucariota, un organismo estinto, oppure può essere creato artificialmente in laboratorio. Utilizzando la clonazione molecolare possiamo imparare di più sulla funzione di un particolare gene.

In secondo luogo, hai bisogno di un vettore. Un vettore è il DNA plasmidico utilizzato come strumento in biologia molecolare per fare più copie o produrre una proteina da un determinato gene. I plasmidi sono un esempio di vettore e sono circolari, extra cromosomici, DNA che viene replicato dai batteri.

Un plasmide ha tipicamente un sito di clonazione multipla o MCS, quest'area contiene siti di riconoscimento per diverse endonucleasi di restrizione note anche come enzimi di restrizione. Diversi inserti possono essere incorporati nel plasmide con una tecnica chiamata legatura. Il vettore plasmidica contiene anche un'origine di replicazione, che gli consente di essere replicato nei batteri. Inoltre, il plasmide ha un gene antibiotico. Se i batteri incorporano il plasmide, sopravviverà nei mezzi che contengono l'antibiotico. Ciò consente la selezione di batteri che sono stati trasformati con successo.

L'inserto e il vettore sono clonati in un organismo di cellule ospiti, il più comunemente usato nella clonazione molecolare è E. coli. E. coli cresce rapidamente, è ampiamente disponibile e ha numerosi vettori di clonazione diversi prodotti commercialmente. Gli eucarioti, come il lievito, possono anche essere usati come organismi ospiti per i vettori.

Il primo passo della procedura generale di clonazione molecolare consiste nell'ottenere l'inserto desiderato, che può essere derivato da DNA o mRNA di qualsiasi tipo di cellula. Il vettore ottimale e il suo organismo ospite vengono quindi scelti in base al tipo di inserto e a ciò che alla fine verrà fatto con esso. Una reazione a catena della polimerasi o un metodo basato sulla PCR viene spesso utilizzato per replicare l'inserto.

Quindi, utilizzando una serie di reazioni enzimatiche, l'inserto e il digesto vengono uniti insieme e introdotti nell'organismo ospite per la replicazione di massa. I vettori replicati vengono purificati dai batteri e, dopo la digestione delle restrizioni, analizzati su un gel. I frammenti purificati in gel vengono successivamente inviati per il sequenziamento per verificare che l'inserto sia il frammento di DNA desiderato.

Diamo uno sguardo un po 'più dettagliato a come viene condotta la clonazione molecolare. Prima di iniziare, ti consigliamo di pianificare la tua strategia di clonazione, prima di fare qualsiasi tentativo di clonazione al banco. Ad esempio, qualsiasi vettore plasmidico fornito un numero finito di siti di restrizione per incorporare l'inserto tramite il sito di clonazione multipla. Dovrai scegliere i siti di restrizione che non si trovano nel tuo inserto in modo da non tagliarlo. Potresti essere lasciato con una situazione in cui sei costretto a unire un frammento finale smussato con uno che ha una sporgenza. In tal caso, l'utilizzo del frammento di klenow per impostare una legatura smussata potrebbe essere l'unica opzione per ottenere l'inserto nel vettore desiderato. Comprendere i vari strumenti di clonazione molecolare a tua disposizione, così come elaborare un'attenta strategia prima di iniziare la clonazione può essere un immenso risparmio di tempo.

La fonte di DNA per la clonazione molecolare può essere isolata da quasi tutti i tipi di cellule o campioni di tessuto attraverso semplici tecniche di estrazione. Una volta isolata, la PCR può essere utilizzata per amplificare l'inserto.

Una volta amplificato l'inserto, sia esso che il vettore vengono digeriti dagli enzimi di restrizione, noti anche come endonucleasi di restrizione.

Una volta digerito, l'inserto e il vettore possono essere eseguiti su un gel e purificati da un processo chiamato purificazione del gel. Per quanto riguarda il vettore, questo passaggio aiuterà a purificare il plasmide linearizzato dal plasmide non tagliato, che tende ad apparire come uno striscio ad alto peso molecolare su un gel.

Dopo la purificazione del gel dei digest, l'inserto viene legato o unito al plasmide, tramite un enzima chiamato DNA ligasi.

In generale, è sempre una buona idea impostare le legature, in modo che il rapporto tra inserto e vettore sia 3 a 1, il che garantisce che solo una piccola quantità di vettore si auto-ligate. Una volta che la legatura è stata impostata sul ghiaccio, viene incubata ovunque da 14-25 ° C da 1 ora a durante la notte.

Successivamente, viene eseguita la trasformazione per introdurre il vettore plasmidido nell'ospite che lo replicherà.

Dopo la trasformazione i batteri vengono placcati su piastre di agar con antibiotico e incubati durante la notte a 37° C. Poiché il plaside contiene un gene di resistenza agli antibiotici, la trasformazione di successo produrrà colonie batteriche se coltivate su piastre di agar in presenza di antibiotici. Le singole colonie possono quindi essere prelevate dalla piastra trasformata, poste in mezzi di crescita liquidi in tubi numerato e messe in un incubatore vibrante per l'espansione. Un piccolo volume di coltura liquida viene aggiunto a una piastra di agar numerato, mentre il resto della coltura passa alla purificazione del plasmide. Lo schema di numerazione che denota l'identità delle colonie batteriche da cui i plasmidi saranno eventualmente purificati viene mantenuto durante tutto il processo di purificazione del plasmide.

Un campione di plasmide purificato viene quindi tagliato con enzimi di restrizione. Il digest viene quindi caricato ed eseguito sul gel in modo da verificare la presenza di inserto, che verificherà che la colonia batterica sia stata trasformata con un plasmide contenente un inserto e non plasmide autolezionato. I batteri verificati per essere stati trasformati con un plasmide contenente inserto, vengono espansi per un'ulteriore purificazione del plasmide. Il sequenziamento viene utilizzato come fase di verifica finale per confermare che il gene di interesse è stato clonato.

La clonazione molecolare può essere utilizzata per un numero quasi illimitato di applicazioni. Ad esempio, quando un modello di mRNA viene trascritto inversamente per formare cDNA, o DNA complementare, da un enzima chiamato trascrittasi inversa e quindi la PCR viene utilizzata per amplificare il cDNA, la clonazione molecolare può essere utilizzata per creare una libreria di cDNA - una libreria di tutti i geni espressi da un determinato tipo di cellula.

La clonazione molecolare può anche essere impiegata per prendere una serie di geni, o cluster di geni da un ceppo batterico, riorganizzarli in plasmidi che vengono trasformati in un altro ceppo, in modo che un intero percorso biosintetico possa essere ricreato per produrre una molecola complessa.

Attraverso la clonazione molecolare, una libreria mutante può essere generata esprimendo un plasmide bersaglio in uno speciale ceppo batterico che utilizza una polimerasi soggetta a errori quando coltivata a determinate temperature. Le mutazioni possono essere caratterizzate dal sequenziamento. I batteri trasformati con geni mutanti possono quindi essere testati con diversi farmaci o sostanze chimiche per vedere quali colonie batteriche si sono evolute per avere resistenza ai farmaci.

Grazie alla clonazione molecolare, i geni reporter possono essere incorporati nei plasmidi del DNA, un gene reporter comune è la proteina fluorescente verde o GFP, che emette una fluorescenza verde quando esposta alla luce UV. Un gene reporter può anche essere inserito in un alphavirus per mostrare l'infezione nelle zanzare e la trasmissibilità nelle cellule.

Hai appena visto il video di JoVEs sulla clonazione molecolare. Ora dovresti capire come funziona la clonazione molecolare e come la tecnica può essere utilizzata in biologia molecolare. Come sempre, grazie per aver guardato!

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