Fizyolojik Akış Koşullarında Sirkülasyon Hücre Kemokin-yönettiği Ekstravazasyon Eğitim Bir Roman Üç boyutlu Akış Odası Cihazı

Aşağıdaki deneyin genel amacı, dolaşımdaki hücrelerin bir kemokin gradyanına doğru kantitatif olarak ölçülmesidir. Fizyolojik saf stres koşulları altında, bu, önce tek katmanlı bir endotel hücresinin kollajen kaplı mikro gözenekli ekler üzerine kültürlenmesi ve daha sonra bunların, kemokin içeren ayrı bir statik bölmeyi kapladıkları bir akış odasına monte edilmesiyle elde edilir. Daha sonra damar sistemindeki fizyolojik koşulları taklit etmek için hücrelere kesme gerilimi uygulanır.

İkinci adım olarak, lökositler, kök hücreler veya tümör hücreleri gibi ilgilenilen test hücrelerinin dolaşım sırasında 3D sistemde dolaşmasına izin verilir. Statik bölmedeki içerik, dolaşımdaki hücreler ve endotel hücreleri arasındaki etkileşimlerin verimliliğini ve ardından test hücrelerinin endotel tabakası boyunca transmigrasyon hızını etkiler. Daha sonra, 3D sistem demonte edilir ve çeşitli son teknoloji yöntemler kullanılarak hücre izasyonunu kantitatif olarak ölçmek için alt statik bölmeden trans migrasyonlu test hücreleri toplanır, dolaşımdaki test hücrelerinin fizyolojik akış koşulları altında endotel hücreleri ile etkileşime girme ve statik bölmedeki kemokin konsantrasyonuna bağlı olarak dolaşımdan çıkma yeteneğini gösteren sonuçlar elde edilir.

Bu tekniğin, paralel lamina akış odalarının kullanımı ve statik transfer tahlilleri gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, hem üst bölmedeki gerilimi hem de alt statik bölmedeki kinleri birleştirmesidir. Bu, araştırmacıların dolaşımdaki hücrelerin akraba gradyanına ve fizyolojik akış koşullarına dışsallaştırılmasını nicel olarak ölçmelerini sağlar. Bu yöntem aynı zamanda lokal mikroçevre hücreleri ile endotel hücreleri arasındaki karışmanın dolaşımdaki hücrelerin ekstravazasyonu üzerindeki etkisini incelemek için de kullanılabilir.

Endotel hücrelerinin altındaki ayrı bir ek parçada ek bir hücre katmanına yardım ederek, prosedürü gösteren Valentina, laboratuvarımdan bir teknisyen olan rova'ya karşı olacak. Başlamak için, deney için gereken kesici uç sayısını hesaplayın ve her bir kesici ucu ayrı bir steril Petri kabına yerleştirin. Bireysel kurulumlara bağlı olarak toplam doz 11 griye ulaşana kadar gama ışınlaması ile sterilize edin.

Ardından stok kolajeni seyreltin. Dört santigrat derecede saklanan 0.01 molar hidroklorik asit kullanarak mililitre başına 50 mikrograma kadar bir çözelti yazın ve her bir uç için nihai çözeltinin 154 mikrolitre alikotunu hazırlayın. Daha sonra, bir Eloqua'dan birkaç damlayı dairesel bir desende ekin yüzeyine yerleştirin.

Ardından, kesici uç yüzeyinde büyük bir damla oluşturmak için alikotun geri kalanını ekleyin. Pipet ucunun hiçbir noktada ek parçaya temas etmediğinden ve kolajenin ek parçanın tüm yüzeyini kapladığından, ancak dışarı akmadığından emin olun. Ek parça kapatıldıktan sonra, kapağı Petri kabının üzerine yerleştirin ve dikkatlice düz bir yüzeye yerleştirin.

İnkübasyondan sonra ekleri oda sıcaklığında bir saat inkübe edin, kollajen solüsyonunu aspire edin ve zarı 160 mikrolitre PBS ile yıkayın. Ardından PBS'yi aspire edin. Kapağı değiştirin ve tabağı paraform ile sarın.

Ekler aynı gün kullanılacaksa, Petri kabını oda sıcaklığında kuru bir yere koyun. Aksi takdirde, tabağı dört santigrat dereceye yerleştirin ve eki yedi gün içinde kullanın. Kültürlenmiş insan göbek damarı endotel hücrelerini kullanmadan hemen önce hasat edin ve bunları mililitre başına 2,5 milyon hücrede istenen kültür ortamında yeniden askıya alın.

Hücreleri sayarken, trian mavisi kullanarak hücre canlılığının %98'den büyük olduğundan emin olun, ardından her bir ekin üzerine 160 mikrolitre hücre süspansiyonu ekleyin. Önce kollajen kaplı ekin yüzeyine bir daire şeklinde birkaç küçük damla yerleştirerek ve ardından büyük bir damla oluşturmak için hücre süspansiyonunun geri kalanını dikkatlice ekleyerek. Bittiğinde, kapakları değiştirin ve bulaşıkları 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit içeren bir inkübatöre dikkatlice yerleştirin ve hücrelerin zara yapışmasını sağlamak için 30 dakika inkübe edin.

30 dakika sonra, plakaları inkübatörden çıkarın ve her bir parçanın üzerine yavaşça beş mililitre ön ısıtma kültür ortamı ekleyin. Ek parçanın tabağın dibinde kaldığından ve tamamen ortamla kaplandığından emin olun. Sonra kapakları değiştirin ve bulaşıkları dikkatlice inkübatör kültürüne geri koyun.

Hücreler gece boyunca 37 santigrat derecede. Önce akış odasını monte etmek için üst ve alt plakaları birbirine vidalayın. Ardından, 0,8 milimetre kalınlığında duvarlara sahip 1,42 milimetre delikli PVC boru kullanarak plakaları gaz değişim ünitesine bağlayın.

Daha sonra, monte edilmiş cihazı temiz bir plastik torbaya koyun ve toplam doz 11 griye ulaşana kadar gama ışınlaması ile sterilize edin. Bir sonraki adım, bir inkübatör tepsisini çıkarmak, steril bir doku kültürü başlığına yerleştirmek ve %70 etanol ile sterilize etmektir. Ardından tepsiyi büyük bir steril peçete ile örtün.

Ardından, cihazı plastik torbadan çıkarın ve steril inkübatör tepsisine yerleştirin. Ardından cihazı peristaltik pompaya bağlayın ve pompayı dakikada 0,2 mililitre hızında çalışacak şekilde programlayın. İstenen kültür ortamının beş ila yedi mililitresini, giriş için kullanılacak steril 15 mililitrelik bir tüpe pipetleyin.

Ardından, borunun sterilitesini korumak için küçük steril peçeteler kullanarak metal iğneyi borudan çekerek giriş borusunu çıkıştan ayırın, metal giriş iğnesini ortamla birlikte 15 mililitrelik tüpe yerleştirin ve çıkış tüpünü boş 15 mililitrelik tüpe yerleştirin. Ardından, pompayı açın, böylece akış saat yönünün tersine olur. Negatif basıncın ortamı 15 mililitrelik giriş borusundan boruya çekmesine izin verin ve ortam, cihaza girmeden hemen önce borunun sonuna ulaştığında pompayı durdurun.

Daha sonra tüp plakalarını sökerek cihazı açın ve üst plaka pipetini 1500 ila 1.550 mikrolitre ortamı alt kuyucuklara dikkatlice çıkarın, kuyucukların alt plakanın bir ila iki milimetre üzerine ulaşan bir yarım küre oluşturmak için yeterli ortam içerdiğinden emin olun. Daha sonra, hazırlanan ekleri petri kaplarından alt plakanın kuyularına aktarın. Steril bir forseps kullanarak, eklerin altında kabarcık sıkışmadığından emin olun ve alt plakanın yüzeyinde görünen herhangi bir ortamı aspire edin.

Ardından üst plakayı tekrar alt plakaya yerleştirin ve yeniden bağlayın. Vidaları kullanarak hemen peristaltik pompayı açın ve ortamın 3D cihazdan akmasına izin verin. Plakalar arasındaki boşlukta kabarcık oluşumunu önlemek için cihazın çıkış ucunu kaldırın ve hazneyi bu konumda tutun.

Hazneyi gaz değişim ünitesine bağlayan boruyu, gaz değişim ünitesine ulaşana kadar orta ile doldurmaya devam edin. Ardından, gaz değişim ünitesine üç mililitre orta yerleştirin. Pompayı açın ve hava kabarcıklarının içinden geçmesine izin verin.

Ortamın kendisinden çıkan boruyu doldurmasına izin vermek için üniteyi yükseltin ve ortamın bitimine iki ila üç santimetre kala pompayı durdurun. Tamamen astarlandıktan sonra, küçük steril peçeteler kullanarak giriş iğnesini çıkış borusuna bağlayın. Ardından, ortam gaz değişim ünitesine doğru saat yönünde akacak şekilde pompayı ters çevirin ve kalan hava kabarcıklarının giderildiğinden emin olun.

Pompa tekrar saat yönünün tersine akarken. Gaz değişim ünitesine 100 mikrolitre test hücresi süspansiyonu ekleyin. Ardından solunum cihazının kapağını kapatın.

Tepsiyi inkübatöre geri yerleştirin ve test hücrelerinin cihazda 37 santigrat derecede dolaşmasına izin verin. İstenilen süre geçtikten sonra, çalışma sistemi olan tepsiyi inkübatörden çıkarın ve davlumbazın içine yerleştirin. Pompayı durdurun, giriş ve çıkışı ayırın ve uçları boş steril 15 mililitrelik tüplere yerleştirin.

Ardından pompayı açın ve hücre süspansiyonunu sistemden toplayın. Hücre süspansiyonunu kullanana kadar buzun üzerine yerleştirin. Ardından, vidaları sökerek ve üst plakayı kaldırarak hazneyi sökün.

Ekleri alt plakadan çıkarın ve boyama veya hücre toplama için petri kaplarına aktarın. Son olarak, hücre süspansiyonunu alt kuyucuklardan çıkarın ve 15 mililitrelik tüplere yerleştirin. Her bir kuyuyu 1,5 mililitre orta ile iki kez durulayın ve ilgili tüpüne ekleyin.

Daha sonra tüpleri 200 Gs'de beş dakika boyunca santrifüjleyin ve hücreleri, gösterilen eşlik eden metin protokolünde listelenenler gibi belirli deneysel hedeflere göre işleyin. İşte bu sistem kullanılarak gerçekleştirilebilecek birçok testten birine bir örnek. Kurulum, eklerin altında beş mikron gözenekli ekler üzerinde büyütülen kemik iliği kaynaklı endotel hücrelerinin aynalanmasından oluşur: stromal hücre türetilmiş faktör bir veya SDF, mililitre başına sıfır, beş veya 50 nanogram konsantrasyonlarda eklendi.

Kemik iliği hücrelerinin 3D sistemde dolaşmasına izin verildi. Ek parçadan göç eden hücreler toplandı ve daha sonra Metilselüloz ortamı ile plakalar üzerinde kültürlendi. Progenitör hücrelerin koloni oluşturmasına neden olan hematopoetik büyüme faktörlerinin varlığında, her bir oyuktaki progenitör sayısını belirlemek ve sdf'ye doğru göç etme yeteneklerini ortaya çıkarmak için 14 gün sonra koloni sayısı skorlandı.

Biri fizyolojik akış koşulları altında. Statik odadaki alt ekte büyütülen stromal fibroblastların eklenmesiyle, sdf ilavesiyle daha fazla hematopoietik hücre, mililitrede 50 nanogramda bir tane olmak üzere dolaşımdan odaya göç etti. Bu teknik, tıp ve biyoloji bilimlerinin farklı alanlarındaki araştırmacıların, in vitro olarak dokuya özgü vasküler yatakları modellemeleri ve dolaşımdaki hücrelerin hastalıklı dokulara karşı normal dokulara göçüne aracılık eden hücresel ve moleküler mekanizmaları keşfetmeleri için yol açtı.