Laminer Akış Kesme Stres altında endotel progenitör hücrelerin değerlendirin Paralel plakalı Akış Odası ve Sürekli Akış Devre
17 Ocak 2012
Steril bir sürekli akış devresi, laminer akış kayma gerilmesi tabi yapışık hücrelere için bir yöntem tarif. Hücrelerin yapışma, morfoloji, şeffaf oda ile devre metaboliti analizi ve gelecek deneyler ya da kültür için kayma maruz kaldıktan sonra hasat hücreleri için alınan numuneler incelenmiştir olabilir.
Bu video makalesinin genel amacı, yapışık hücreleri laminer akış koşullarına maruz bırakmak ve iyi ölçülebilir sıvı kesme gerilmelerine yanıtı değerlendirmek için bir tekniği tanımlamaktır. Bu, önce akış devresinin akış odası olmadan monte edilmesiyle gerçekleştirilir. Devre, rezervuar darbesi, sönümleyici, sert boru, yumuşak boru, dört durdurma muslukları ve bağlı yem adaptörlerinin yanı sıra bir hava filtresi içerir.
Bir sonraki adım, devreyi steril koşullar altında hücre ortamı gibi istenen bol sekiz ile doldurmak ve ardından darbe sönümleyiciyi doldurmak ve hava borusunu boşaltmak için pompayı çalıştırmaktır. Bunu, hücreye oturan sürgünün akış odasının alt plakasına yerleştirilmesi takip eder. Prosedürün son adımı, akış odası aynı hizada olacak şekilde akış devresinin tam montajıdır.
Sonuç olarak, hücrelerin fonksiyonel davranışını incelemek için bir floresan mikroskobu kullanarak şeffaf odadan sıvı kesme stresine maruz kalma altında floresan etiketli endotelyal progenitör hücrelerin hizalanmasını gösteren sonuçlar elde edilebilir. Hücreleri sıvı kesme stresine maruz bırakarak in vivo fizyolojiyi taklit etmek sıklıkla gereklidir. Hücreleri akış koşulları altında incelememize ve şeffaf odadan gözlemlememize olanak tanıyan paralel bir plaka akış odası ve sürekli akış devresi tasarladık.
Bu teknik, tıp ve mühendislik alanları için değerli bir araştırma aracı olarak hizmet edebilir. Akış odamız, dik veya ters mikroskop kullanarak akış altındaki hücrelerin aralıklı veya gerçek zamanlı olarak görselleştirilmesini sağlar. Ayrıca, Dr.Ach Nick'in tasarımı, araştırmacıların standart mikroskop lensleri kullanarak şeffaf veya radyoopak yüzeylerdeki hücreleri görüntülemelerine olanak tanır.
Ayrıca, ilaçların akış koşulları altında hücreler üzerindeki etkisini incelemek için farmakoloji araştırmalarında önemli bir araç olabilir. Kurulumun görselleştirilmesi kritik öneme sahiptir, çünkü birçok adımın tek başına bir protokolü okuyarak ustalaşması zordur. Akış devresini monte etmek için Dr.Ock Next'in laboratuvarında yaygın olarak kullanılan akış odasının ve akış devresinin nasıl kurulacağına dair adım adım talimatlar vereceğim.
Darbe sönümleyicinin bir ucuna diğer ucuna 36 inçlik bir sert boru segmenti takarak başlayın. 18 inçlik bir yumuşak boru segmenti takın. 18 inçlik yumuşak boru bölümünün sonuna sekizde bir inçlik bir erkek yem adaptörü yerleştirin.
Erkek yemi sekizde bir inçlik dişi yem adaptörüne bağlayın. Dişi yemi 18 inçlik yeni bir yumuşak boru segmentine takın. 250 mililitrelik bir cam beher kapağına üç delik açın.
Boruyu takmak için, bir deliğe 1.5 inçlik bir yumuşak boru segmenti yerleştirin. Bir havalandırma deliği olarak. Sert ve yumuşak borunun serbest uçlarını kapaktaki diğer iki delikten rezervuar görevi görecek 250 mililitrelik cam şişeye yerleştirin.
Sert borunun rezervuarın dibine ulaştığından emin olun. Devrenin kurulumu boyunca sterilitenin korunması, bu prosedürün başarısı için çok önemlidir. Bu nedenle, tüm parçalar sterilize edilmeli ve baştan sona steril eldiven giymelisiniz.
Monte edilen parçalara ek olarak, bu parçalar sterilize edilmelidir. Bir tam akış odası, üç ila iki inç yumuşak boru segmenti, bir erkek ve bir dişi, bir sekizinci inç yem adaptörü, dört adet yarım inç düz başlı vida, 6 5 16 inç, sekiz 30 saniye. İnç başına inç izler, düz başlı vidalar, bir cımbız, bir cam slayt ve buharla sterilize edilmiş iki havlu.
121 santigrat derecede 60 dakika otoklavlama. Akış devresi akış odasını dörde dört yollu durdurma musluklarını tek tek yerleştirin, musluğu ve tüm sterilize edilmiş parçaları bu steril alana yerleştirin. Steril eldiven giyerken, iki dört durdurma musluğunu bağlayın.
Açık numune bağlantı noktalarına kapakları yerleştirin. Akış devresinin iki yumuşak boru segmentini takan erkek ve dişi yem adaptörlerini ayırın ve bağlı durdurma musluklarını takın. Rezervuara yerleştirilen yumuşak boruyu 30 mililitrelik bir şırıngaya takın ve şırınga pistonunu çıkarın.
Şişeyi 125 mililitre EPC ortamı ile doldurun. Yumuşak boruyu durdurma musluğuna yeniden bağlayın. Havalandırma deliğine steril bir şırınga filtresi yerleştirin.
Şimdi akış devresini 37 santigrat derece,% 5 karbondioksit sıcaklıkta nemlendirilmiş bir inkübatöre aktarın. Sert boruyu, bu tip kömür Palmer borusu ile kullanım için belirtilen ana esnek silindirli pompa kafasına sıkıştırın. Borunun makaralı pompa montaj rayları ile örtüşmediğinden emin olun.
Boruyu, pompa kafasından çıktığı yeri her iki tarafta bir işaretleme kalemi ile işaretleyin. Tüm durdurma musluklarının numune portlarına doğru kapatıldığından ve akış devresi boyunca açıldığından emin olduktan sonra pompayı çalıştırın. Akış yönünü doğrulayın.
PERFUSE sekizli, cam hazneden sert borudan nabız sönümleyiciye hareket etmelidir. Akış odası montajı için, iki inçlik bir yumuşak boru segmentini sekizde bir dişi yem adaptörüne bağlamak için steril eldivenler kullanın. Başka bir iki inçlik yumuşak boru segmentini sekizde bir inçlik erkek yem adaptörüne bağlayın.
Dişi yem adaptörlü iki inç yumuşak boruyu giriş portuna ve erkek yem adaptörlü iki inç yumuşak boruyu çıkış portuna takın. Bu yem adaptörlerinin her ikisine de dört durdurma muslukları takın. Kalan iki inçlik yumuşak boru parçasını kabarcık tuzağından çıkan yan bağlantı noktası konektörüne bağlayın ve steril cımbız kullanarak tek yönlü bir durdurma musluğu takın.
Hücre tohumlu slaytı hücre kültürü kabından çıkarın ve akış odasının alt plakasındaki girintiye yerleştirin. Sürgünün, hücrenin oturduğu tarafı yukarı bakacak şekilde yerleştirildiğinden emin olun, bir şırınga veya pipet kullanarak, hücrenin oturduğu sürgünün üzerine 10 mililitre ılık EPC ortamı yerleştirin. Ortamın akış odasındaki sürgüyü kaplamasına izin verin, ancak ortamı alt plakadaki O-ringin üzerine dökmeyin.
Akış odasının üst plakasını, vida deliklerini hizalayarak alt plakaya yerleştirin. Hazne vida plakalarına hava kabarcıkları girmemesi için iki plakayı paralel tutun. Beraber. Otomatik pille çalışan bir tornavida kullanarak, giriş tarafı kabarcık tuzağı portuna bağlı tek yönlü durdurma musluğunu açarak giriş kabarcık tuzağını havalandırın.
Giriş borusunu EPC ortamıyla nazikçe yıkamak için 10 mililitrelik bir şırınga kullanın ve ardından bu durdurma musluğunu kapatın ve kapatın. Şimdi de çıkış portu dört yollu durdurma musluğunu açarak ve EPC ortamını akış odasından nazikçe yıkayarak oda kanalını havalandırın. Yine 10 mililitrelik bir şırınga kullanarak dört yollu durdurma musluğu bağlantılarının tümünü kapatın ve kapatın.
Akış odasını, monte edilmiş akış devresi ile nemlendirilmiş inkübatöre aktarın. Akış devresini duraklatın, pompayı akış devresini kapatın. Sızıntıyı önlemek için muslukları akış yönünde durdurun.
Akış odasını akış devresine bağlayın Akış odası akış devresine bağlandıktan sonra, durdurma musluklarını akış yönünde açın. Akış pompasını devam ettirin ve PERFUSE sekizinin doğru yönde aktığından emin olun. Akış hızını istenen saf gerilime ayarlayın.
Akış deneyi sırasında, hücreleri ışık veya floresan mikroskobu ile görüntülemek için akış odası devreden çıkarılabilir. Bunu yapmak için, musluk bağlantılarını durdurmak için akış odasını durdurma musluğundaki akış devresinden ayırın. Analiz için perfüze sekiz numune toplamak için.
İlk olarak, pompayı duraklatın, darbe sönümleyiciye en yakın bulunan durdurma musluğunu kapatın. Kirlenmediğinden emin olmak için baş aşağı yerleştirerek koruyucu kapağını çıkarın. Numune portuna küçük bir şırınga yerleştirin.
Durdurma musluğunu akış odası yönünde kapatın, numune portunu ve darbe sönümleyici yönündeki devreyi açık tutun. İstenilen miktarda numune çekinampdevreden, şırıngayı çıkarmadan önce vanayı numune portuna doğru kapatın. Bol sekiz numuneyi etiketli bir şişede saklayın ve eksi 80 santigrat derecede dondurun.
Numune portunu yeniden kapatın ve akışa başlamadan önce tüm muslukların açık olduğundan emin olun. Bu yöntem kullanılarak, insan kanından elde edilen endotelyal progenitör hücreler 15 dakika içinde titanyum slaytlar üzerine ekilebilir ve fizyolojik kesme kuvvetleri altında yapışabilir. Bu şekilde gösterildiği gibi, EPC'ler, tohumlamadan hemen sonra yaklaşık 210 mikrondan üç saat sonra yaklaşık 657 mikrona ve santimetre kare başına 15 dine 48 saatlik sıvı kesme gerilmesinden sonra yaklaşık 1.152 mikrona akışın etkisi altında yayılır.
Bu ışık mikroskobu görüntüsü, insan EPC'lerinin rastgele yönelimini göstermektedir. Santimetre kare başına 100 yemekte üç saatlik akıştan sonra altı saatlik statik bir oturma süresinden sonra, hücreler yayılmış ancak rastgele bir yönelimde kalmıştır. Santimetre kare başına 100 dine'de 48 saatlik sıvı kesme geriliminden sonra, EPC'ler hizalanır ve akış yönünde yönlendirilir.
Burada EPC'ler, CTO ile etiketlendi ve hücre çekirdekleri, akıştan sonra ölmek üzere herx ile boyandı. Karşılaştırma için, bu görüntü, akış yönü ile aynı hizada titanyum slaytlar üzerindeki domuz EPC'lerini göstermektedir. 48 saatlik akış ve santimetre kare başına 15 dinleme kesme gerilimine maruz kaldıktan sonra, hücre sınırları anti pcam boyası ve çekirdekler sitoksin nükleik asit boyası ile boyandı.
Bu yöntem aynı zamanda, salgılanan hücre metabolitlerinin analizi ve/veya miktarının belirlenmesi için önceden belirlenmiş zaman noktalarında PERFUSE sekiz numunelerinin elde edilmesine de izin verir. Burada, domuz EPC'leri ile 48 saatlik bir akış deneyi sırasında nitrit üretimine bir örnek gösterilmektedir. Bu prosedürü denerken, steriliteyi baştan sona korumak önemlidir.
Ek olarak, hücreleri koparabilecekleri için sürekli akışın başlamasından önce akış odasındaki hava kabarcıklarının sayısını azaltmak için gerekli adımların atılması önemlidir. Ayrıca, bir deney sırasında PERFUSE sekiz'in sızmasını önlemek için füzyondan önce akış odası ve devresindeki her bir bağlantıyı kontrol etmenizi öneririz. Bu hazne, üst ve alt plakaların tamamen birbirine geçmesine izin veren ve vakum pompaları gerektirmeden sızdırmaz bir sızdırmazlık sağlayan yerleşik O-ringlerle tasarlanmıştır.
Bu özellik aynı zamanda deneyler arasında sabit bir hazne yüksekliği sağlar ve lastik conta veya ayar ihtiyacını ortadan kaldırır. Akış odamızda standartlaştırılmış mikroskop slaytları kullanılmaktadır. Bu nedenle, daha fazla deney için çok sayıda hücre mevcuttur.
Örneğin, akıştan sonra hücrelerden gelen RNA ve DNA, protein sentezi veya gen ekspresyonu için değerlendirilebilir. Devre tasarımımız, sıvı kesme stresi altındaki hücreler tarafından salgılanan nitrik oksidin birincil oksidatif metaboliti olan nitrit gibi hücre metabolitlerinin analizi ve miktarının belirlenmesi için perfüz sekiz numunesinin toplanmasına izin verir. Bu videoyu izledikten sonra, yapışma hücrelerini sıvı kesme gerilimine maruz bırakmak için akış odamızı ve steril akış devremizi nasıl monte edeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.
Genel Bakış
Bu makale, yapışkan hücreleri laminer akış kesme gerilimi altına sokmak için steril sürekli akış devresi kullanarak bir yöntemi açıklar. Teknik, şeffaf bir hazne aracılığıyla hücre yapışması ve morfolojisinin incelenmesine olanak tanır, bu da maruziyet sonrası metabolit analizi ve hücre hasadı mümkün kılar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Hücre Biyolojisi
- Akış Mekaniği
- Biyomedikal Mühendisliği
Arka Plan
- Kesme gerilimi altında hücre davranışı anlamak, in vivo koşullarını taklit etmek için kritik öneme sahiptir.
- Akış kesme gerilimi, çeşitli hücresel işlevleri ve tepkileri etkiler.
- Paralel plaka akış haznesinin tasarımı, bu etkilerin çalışmasını kolaylaştırır.
- Akış koşullarında hücrelerin görselleştirilmesi, doğru analiz için esastır.
Çalışmanın Amacı
- Yapışkan hücrelere kesme gerilimi uygulamak için güvenilir bir yöntem geliştirmek.
- Akış kesme gerilimi ile hücresel tepkiyi nicel olarak değerlendirmek.
- Tıp ve mühendislik alanındaki araştırmacılar için bir protokol sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Çeşitli hortumlar ve duraklama vanaları içeren bir akış devresi montajı.
- Devreyi steril koşullar altında hücre ortamı ile doldurma.
- Gözlem için hücre ekilmiş bir slaytın akış haznesine yerleştirilmesi.
- Hücre hizalamasının kesme gerilimi altında görselleştirilmesi için floresan mikroskobunun kullanılması.
Ana Sonuçlar
- Floresan olarak etiketlenmiş endotelyal progenitör hücrelerin başarılı bir şekilde hizalandığı gözlendi.
- Akış haznesi tasarımı, hücresel tepkilerin gerçek zamanlı görselleştirilmesine izin verir.
- Sonuçlar, hücre davranışı çalışmasında kesme gerilimi önemini göstermektedir.
- Bu yöntem, ilaç etkilerini hücreler üzerinde değerlendirmek için farmakolojide uygulanabilir.
Sonuçlar
- Bu teknik, mekanik güçlere karşı hücresel tepkiler inceleyen araştırmacılar için değerli bir araçtır.
- Fizyolojik koşullarda hücre davranışı anlayışını artırır.
- Protokol, çeşitli hücre tipleri ve deneysel koşullar için uyarlanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Quantitative evaluation of endothelial progenitor cells (EPCs) under controlled laminar flow shear stress addresses a critical gap in modeling vascular biology for early-stage drug discovery. This platform enables reproducible assessment of cell adhesion, morphology, and metabolite secretion under physiologically relevant mechanical forces, supporting predictive confidence in vascular target validation. The scalable recovery of viable cells and secreted factors positions this method as a reusable asset for portfolio-wide mechanistic de-risking and translational research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of mechanosensitive pathways in EPCs and other adherent cell types.
- Supports functional target validation by quantifying cellular alignment and secreted metabolites under defined shear stress.
- Facilitates biological de-risking by mimicking in vivo vascular conditions in a controlled ex vivo system.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized, sterilizable platform for reproducible cell-based assays under flow.
- Allows for high-yield recovery of cells and perfusate for downstream molecular analyses.
- Enables quantitative readouts of cell morphology, adhesion, and metabolite secretion for assay optimization.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro mechanical stimulation with disease-relevant vascular biology for translational biomarker studies.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling collection of RNA, DNA, and secreted factors post-flow.
- Reduces translational risk by modeling physiologically relevant shear stress responses in human and animal EPCs.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis-driven testing of vascular targets, assay development, and translational biomarker alignment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of mechanotransduction and endothelial function under controlled shear stress.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for cell adhesion, morphology, and metabolite secretion.
- Analytics: Facilitates collection and analysis of perfusate for secreted metabolites such as nitrite, supporting comparative studies.
- Translational Research: Enables alignment of in vitro findings with in vivo vascular responses for biomarker validation.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, sterilizable platform adaptable to multiple cell types and experimental needs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in vascular target validation and mechanistic studies.
- Operational Value: Streamlines assay standardization, reproducibility, and high-throughput sample recovery.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by providing robust, physiologically relevant data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of vascular and mechanosensitive targets across programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in sterile technique and flow system assembly.
- Needs access to incubators, roller pumps, and fluorescence microscopy infrastructure.
- Demands rigorous cross-team standardization of flow rates, chamber dimensions, and sample handling.
- Adaptable to various adherent cell types, but optimization may be needed for cell-specific responses.
- Careful management of air bubbles and leak prevention is essential for experimental success.
