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Biology I: yeast, Drosophila and C. elegans

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초파리 유충 IHC

Overview

면역 조직 화학 (IHC)는 조직 내 단백질의 존재와 위치를 시각화하는 데 사용되는 기술입니다. 드로소필라 애벌레는 염색을 위해 처리될 수 있는 용이성 때문에 IHC에 특히 순종적입니다. 또한, 애벌레는 투명, 일부 조직은 해부없이 시각화 할 수 있다는 것을 의미.

IHC에서, 단백질은 궁극적으로 관심있는 단백질 내의 "에피토프"에 특히 결합하는 항체로 검출됩니다. 이러한 전형을 보존하기 위해서는 염색 하기 전에 조직을 고정해야 합니다. 또한 항체가 막을 침투하기 위해서는 세포가 세제로 침투되어야 합니다. 이 비디오 문서에서는 고정, 차단 및 염색 단계를 포함하여 해부 된 애벌레 조직의 염색에 필요한 시약, 도구 및 절차에 대한 자세한 보기를 제공합니다. 또한 형광 현미경 검사법을 위한 조직 장착 기술의 데모가 특징입니다. 마지막으로 이러한 기술에 대한 광범위한 응용 프로그램(및 일부 변형)의 예가 제공됩니다.

Procedure

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Drosophila 멜라노가스터는 다재다능함과 사용 시설로 인해 널리 연구된 모델 유기체입니다.

Drosophila 애벌레 제제에서 수행된 면역 조직 화학은 단백질의 존재, 위치 및 공동 국소화에 대한 정보를 제공할 수 있는 귀중한 방법입니다.

이 비디오는 Drosophila 애벌레 조직의 해부, 고정, 차단 및 장착에 대한 필수적인 방법과 응용 프로그램의 예를 다룰 것입니다.

면역 조직 화학은 변형 된 항체를 사용하여 조직에서 특정 단백질을 표적으로 하고 결합하고 궁극적으로 시각화하는 과정입니다.

Drosophila 애벌레의 면역 조직 화학은 애벌레 조직의 감도로 인해 정확성과 적시성을 요구하는 적절한 해부에 달려 있습니다.

해부는 전형적으로 인산염 완충식염식염수, 또는 "PBS"에서 짧게 수행됩니다.

추출 기관은 일시적으로 PBS에 배치됩니다 â 유충의 내부 pH와 동일한 pH와 식염수 용액.

드로소필라 애벌레 IHC의 다음 단계를 해부한 후 고정된다.

고정은 조직을 보존하는 희석된 포름알데히드 기반 용액에 조직을 배치하는 과정입니다.

이 고정 용액은 조직에서 단백질의 효소 분해를 방지합니다.

고정 후, PBST라는 Triton-X를 포함하는 PBS를 사용하여 면역 염색 과정 전반에 걸쳐 여러 세척 단계가 발생합니다.

Triton-X100은 표면 장력 차단기 역할을 하는 소량의 세제를 제공하고 세포를 투과화하여 항체 및 기타 시약이 들어갈 수 있게 합니다.

고정 및 세척 후, 조직은 차단할 준비가 되어 있습니다.

차단 용액에는 조직에 결합하고 표적 특이적 항체가 그렇지 않으면 부착할 비특이적 결합 부위를 차지하는 단백질이 포함되어 있습니다. 차단은 거짓 양성 단백질 신호를 방지하는 데 도움이됩니다.

조직을 차단 한 후 염색을 위해 준비됩니다.

염색은 항원에게 불린 표적 단백질에 묶는 높게 특정한 "1 차적인" 항체를 통합합니다.

리포터 분자에 공인하는 "이차" 항체는 1차 항체를 결합한다.

리포터 분자는 종종 자연에서 형광인 시각화할 수 있는 국소화된 신호를 방출합니다.

각 항체 배양 단계에 따라, 과잉 항체는 구체적으로 결합된 어떤 항체든지 제거하기 위하여 떨어져 세척됩니다.

염색 과정 이후에 는 샘플을 장착해야 합니다.

염색 결과를 보려면 조직이 슬라이드에 신중하게 장착해야합니다.

두꺼운 시약 또는 장착 매체는 조직을 감싸는 데 사용됩니다.

견본은 현미경의 밑에 볼 준비가 됩니다.

이제 우리는 Drosophila 면역 요법의 원리를 통과했습니다, 우리는 그것이 어떻게 끝났는지 볼 준비가 되었습니다.

이 비디오에서우리는 고정으로 시작하는 Drosophila 애벌레 뇌의 면역 집중 화학에 사용되는 시약, 도구 및 프로세스에 초점을 맞출 것입니다.

우리가 따르는 과정은 전체 두뇌를 사용하고 전체 마운트 염색으로 알려져있다.

해부 절차는 실험에 사용되는 조직 유형에 따라 다르지만 IHC의 주요 단계는 동일하게 유지되므로 고정 단계로 건너뜁니다.

애벌레 뇌의 해부가 완료되면 파이펫으로 PBS를 제거하십시오.

당신의 특정 프로토콜에 따라 고정 및 인큐베이션을 추가, 두뇌에 대 한 사용 23 분.

고정 후 PBST에서 샘플을 4 번 세척하십시오.

최소 30분 실온을 위한 블로킹 용액에 샘플을 배양합니다.

적절한 희석제사용, 4°C에서 하룻밤 동안 1차 항체 용액에서 배양한다.

인큐베이션 기간 후 실온에서 파이펫 팁으로 PBST에서 4번 뇌를 세척합니다.

형광이 표백되는 것을 방지하기 위해 어둠 속에서 4 °C에서 하룻밤 동안 이차 항체에서 샘플을 배양합니다.

다시 말하지만, PBST에서 네 번 뇌를 씻으십시오.

1 시간 동안 장착 매체에서 뇌를 평형.

평형 후 팁이 끊어진 p200 파이펫을 사용하여 뇌를 슬라이드로 옮길 수 있습니다.

스페이서를 샘플 주위에 배치하여 스페이서가 분쇄되지 않도록 합니다.

샘플 위에 커버슬립을 놓습니다.

매니큐어로 슬립 가장자리를 밀봉합니다. 라발 뇌는 이제 면역 집중화학으로 시각화할 준비가 되었습니다.

이제 우리는 Drosophila 두뇌의 면역 히스토케술을 다루었으니, IHC 절차를 적용하는 몇 가지 다른 방법을 살펴보겠습니다.

대안 해부 및 고정 기술은 화상 진찰을 위한 Drosophila 애벌레를 준비하는 데 이용될 수 있습니다.

이 실험에서 연구자들은 세포가 특정 모양을 생성하는 방법을 배우고 싶어합니다.

그(것)들은 애벌레 기관 단자 세포의 형태를 추적해서 이것을 합니다.

연구원은 GFP를 표현하는 돌연변이 플라이 라인을 이용합니다.

GFP 발현은 수조의 열에 노출되어 유도됩니다.

애벌레는 형광을 가진 해부 현미경의 밑에 선택됩니다.

형광을 방출하는 파리는 GFP의 성공적인 활성화를 나타냅니다.

이 파리는 열에 의한 고정의 다른 형태로 제출됩니다; 해부가 필요하지 않습니다.

추적을 돕기 위해 소프트웨어를 사용한 후 기관 가지 및 루멘의 셀룰러 형태가 식별됩니다.

Drosophila 난소는 줄기 세포가 그들의 세포 환경과 상호 작용하는 방법을 이해하기 위한 훌륭한 모형입니다.

Drosophila 난소의 IHC는 남성에서 명백한 고환 대 난소의 존재에 의해 Drosophila 여성을 식별하 여 시작.

수집된 암컷 유충은 난소를 수용하는 지방체로 알려진 구조를 얻기 위해 신중하게 해부되는 개별 우물로 옮겨진다.

지방 몸은 고정되고 얼룩진 다음 - 슬라이드에 조직을 배치 한 후 - 난소는 지방 신체 조직에서 분리됩니다. 슬라이드를 장착하고 시각화한 후, 형광 염색은 애벌레 난소에서 체세포 및 원시 세균 세포의 위치를 드러낸다.

드로소필라 애벌레의 면역 요법은 푸팔과 성인 IHC와 많은 유사점이 있습니다.

예를 들면, 연구원은 다른 발달 단계에서 Drosophila 망막을 보기 위하여 IHC를 이용할 수 있습니다: 애벌레, pupal 및 성인, 따라서 pupal, larval 및 성인 면역 조직 화학 절차의 차이를 설명합니다.

결과는 Drosophila 망막의 발달의 각종 단계를 보여줍니다.

드로소필라 애벌레의 면역작용제는 다량의 응용 분야와 변형을 가진 도구입니다. 이 비디오에서 우리는 해부, 고정, 얼룩 및 장착을 포함하여 면역 염색 애벌레에 대한 절차를 다루었습니다. 시청해 주셔서 감사합니다!

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