Amphipod Crustacean Sekiz hücreli embriyolardan Tek Hücre Ablasyon Parhyale hawaiensis

Bu gösteri, kapsüldeki erken embriyolardan germ hattı öncü hücresini çıkarma tekniğini göstermektedir. Crustacean parli sys parli, evrimsel ve gelişimsel araştırmalarda kullanım için geniş potansiyele sahip, gelişmekte olan bir model organizmadır. Model eklembacaklıların çoğu böcektir ve bunlardan en kapsamlı şekilde çalışılan meyve sineği Glip Melanogaster böcekleri, alt filum, panc cresta içinde yuvalanmıştır ve böceklerin dışındaki diğer kabukluları incelemek, drosophila'da iyi çalışılmış olan gelişimsel özelliklerin ve moleküler mekanizmaların evrimsel tarihine daha geniş bir bakış açısı sağlar.

Bununla birlikte, çok az sayıda kabuklu, gelişimin deneysel laboratuvar analizi için iyi bir şekilde kurulmuştur. Parelli, son derece izlenebilir bir laboratuvar model sistemidir ve bu nedenle model organizmaların envanterine değerli bir katkı sağlar. Bir laboratuvar hayvanı olarak parlı'nın bakımı ve çalışması çok kolaydır.

Büyük yapay deniz suyu kültürlerinde iyi bir şekilde hayatta kalabilir ve açık morfolojik farklılıklara dayanarak erkekler ve dişiler arasında ayrım yapmak kolaydır. En önemlisi, erkeklerin gelişimsel çalışma için çiftleşme sırasında dişileri kavramak için kullandıkları büyük çengelli ön uzantılar. Parelli'nin çok çekici birkaç özelliği vardır, çiftler tüm yıl boyunca çiftleşir, bu nedenle herhangi bir zamanda embriyo toplamak mümkündür.

Dişiler, embriyoları ilk birkaç çift bacak arasındaki kuluçka kesesine bırakır ve dişiyi öldürmeden veya embriyolara zarar vermeden embriyoları gelişimin çok erken dönemlerinde toplamak mümkündür. Embriyolar, kuluçka yoluyla filtrelenmiş yapay deniz suyunda hayatta kalır ve gelişim boyunca ilerlemenin doğru bir şekilde tanımlanmasını sağlayan ayrıntılı bir evreleme tablosu vardır. Burada gösterilen, gelişimin sekiz hücre aşaması tarafından kuluçka yoluyla paral gelişim aşamalarının bir seçimidir.

Paral embriyodaki hücrelerin her biri, üç germ katmanından birine veya ilkel germ hücrelerine spesifik olarak soluklaşır. Bu gösteride özel bir ilgi alanı olan germ hücresi popülasyonunun spesifikasyonudur. Germ hattı için G hücre adının, parli soy izleme deneylerinde benzersiz germ hattı öncüsü olduğu bilinmektedir, G'nin soyundan gelenlerin tüm germ hücreleri haline geldiğini ve hiçbir soyundan gelenin başka herhangi bir germ katmanının parçası olmadığını göstermektedir.

Ek olarak, hücrelerin geri kalanına zarar vermeden embriyodan G'yi çıkarmak için deneyler yapılmıştır. Bu deneylerde, G'nin çıkarıldığı embriyolar, metazoanlar boyunca model organizmalarda bir germ hattı belirteci olan protein vazasını eksprese eden hücrelerin yokluğu ile gösterildiği gibi, embriyogenezin geri kalanı boyunca germ hücrelerinden yoksundu. Şimdi parli embriyolarının nasıl toplanacağını ve sekiz hücreli bir embriyodan G'nin manuel olarak nasıl ablate edileceğini göstereceğiz.

Bu videoda G'nin çıkarılması gösterilmektedir, ancak sekiz hücre aşamasındaki herhangi bir hücreye uygulanabilir. Prosedürün bu kısmı için, ucu genişletilmiş bir mera pipetine, ikinci bir değiştirilmemiş mera pipetine, filtrelenmiş yapay deniz suyuna, çiftleri barındırmak için büyük bir kap, küçük Petri kaplarına, bir cam kuyu plakası forsepslerine ve bir meranın ucunda ince kavisli bir telden oluşan bir diseksiyon aletine ihtiyacımız olacak. Bu gösterimde pipet eldivenleri kullanılmamıştır, ancak genişletilmiş mera pipetinin önce elmas kalemle pipetin etrafından çentik atmasını sağlamak ve ardından ucunu dikkatlice kırmak için kurumunuzdaki risk yönetimine uygun koruyucu ekipman eklemeyi unutmayın.

Kenarları yumuşatmak için alevi birkaç saniye basılı tutun. Açıklık, pipetin maksimum genişliğinden biraz daha dar olmalıdır. Tel diseksiyon aletini yapmak için, bir cam pipetin ucuna bir tungsten tel yerleştirin ve camı eritmek için bir alevin üzerinde tutun.

Telin yerine sabitlenmesi, aletle en kolay manipülasyon için telin ucunu hafifçe kıvırmak için forseps kullanın. Kancalı ucun uzunluğu yarım santimetreden biraz fazla olmalıdır. Genişletilmiş mera pipetini kullanarak çiftleri toplayın ve ayrı bir yapay deniz suyu kabına aktarın.

Çiftleri gece boyunca oda sıcaklığında bırakın. Ertesi sabah filtrelenmiş yapay deniz suyunu karbondioksit ile demleyin. Ayrılmış dişileri toplayın ve onları bu suda uyuşturun.

Tek bir dişi, diseksiyon mikroskobu altında karbondioksit görüntüleme ile filtrelenmiş yapay deniz suyunda bir cam kuyu plakasına aktarın, vücudun bir tarafı boyunca koksal plakaları forseps ile kavrayın. Embriyolar kuluçka kesesinde görülebilir. Tel diseksiyon aletini kuluçkalık poşetin arka ucuna yerleştirin ve kuluçka kesesi kaplamasını ayırmak, poşeti açmak ve embriyoları açığa çıkarmak için teli yavaşça öne doğru kaldırın.

Açılan kuluçka kesesinden suyu akıtmak için bir mera pipeti kullanın. Embriyoları dışarı itmek. Dişiyi, ana kültüre yeniden sokmadan önce iyileşmesini sağlamak için karbondioksit içermeyen filtrelenmiş yapay deniz suyuna aktarın.

Embriyoları filtrelenmiş yapay deniz suyu ile bir Petri kabına aktarın ve onları evrelemek için mikroskop altında görüntüleyin. Embriyoları dişiden çıkarmadan önce evresini belirlemek çoğu zaman zor olduğundan, doğru aşamada yeterli embriyoya sahip olmak için çoğu zaman embriyoları, birçok dişi embriyoyu toplamamız gerekir. Genellikle sekiz hücreli embriyo elde etmenin en kolay yolu, daha erken aşamalardaki embriyoları toplamak ve doğru aşamaya olgunlaşmalarını beklemektir.

Ablasyon işlemi için daha önce topladığımız embriyolara ek olarak, bir mera pipeti forseps filtrelenmiş yapay deniz suyuna, bir puro tabakası olan bir Petri kabına, çekilmiş bir cam kılcal damardan yapılmış bir iğneye, küçük bir ağzı olan bir ağız pipetine, temiz Petri kaplarına ve ağız ucu için amfoterisin ve penisilin streptomisin ile filtrelenmiş yapay deniz suyuna ihtiyacımız olacak. Pipet: Pipetinizin uzun bir ucunu alev üzerine çekin ve ağzın ucuna sokulan küçük ucun ucunu kırın. Pipet. Bu uç, prosedür için mükemmel boyuttadır.

Ablasyon işlemi sırasında G'yi delmek için kullanılacak olan cam iğnenin ince bir ucu olmalı, ancak corion'a doğru itildiğinde kırılmayacak kadar sağlam olmalıdır. Burada, laboratuvarımızda kullanılan yaygın bir şekil gösterilmektedir. Ablasyon için öncelikle hangi hücrenin G olduğunu belirlemeliyiz, soldaki embriyo siyah ile özetlenen G'yi gösteriyor ve sonraki bölümde G'yi diğer mikro aynalardan nasıl ayırt edeceğimizi öğreneceğiz.

Sağdaki embriyo, başarılı ablasyonunuzun sonucu olarak ne beklemeniz gerektiğini gösterir. Bu embriyoda G, siyah daire ile gösterildiği gibi ablasyon yapılmıştır ve forseps kullanılarak sadece üç mikro meres kalmıştır. Hücreleri görüntülemek ve karşılaştırmak için embriyoyu yavaşça yuvarlayın.

G, en küçük makro meranın üzerine oturan en küçük mikrom olarak tanımlanabilir, MAV ise embriyonun yuvarlanmasıyla en küçük makro sadece olarak tanımlanabilir. Ek olarak, G, karşısındaki mikrom olan EN hücresine dokunmaz. Hücrenin el ve er'i bu embriyo için G ve EN arasında bir sınırı paylaştığından, en küçük mikromun solda yer aldığını görebilir ve karşısındaki mikroma değmediğini görebiliriz.

Embriyoyu yuvarlayarak, bu mikro aynanın en küçük makro ayna üzerinde oturduğunu doğrulayabiliriz. Şimdi embriyonun sol alt kısmında yer alıyor, güvenle G diyebilir ve ablasyona geçebiliriz. Kısaca.

Bu işlem için çekilen cam iğne ile G'yi delerken embriyoyu forseps ile sabitleyeceğiz. Daha sonra forseps ile embriyoya hafif bir baskı uygulayacağız ve G içeriğinin açtığımız delikten embriyoyu terk etmesine neden olacağız. Embriyodan ayrıldıktan sonra G'nin içeriğini çıkarmak için ağız pipetini kullanıyoruz, böylece G'nin ne zaman tamamen çıkarıldığını görebiliriz.

Şimdi bunu ayrıntılı olarak incelemek için, ipek koruma plakasını sığ bir filtrelenmiş yapay deniz suyu tabakasıyla doldurun. Sekiz hücreli bir embriyoyu forseps ile pipetinizi kullanarak plakaya aktarın. Sol elde, embriyoyu G ile sağa yönlendirin ve çekilmiş bir cam iğne kullanarak embriyoyu stabilize etmek için nazikçe kavrayın, hafifçe delinmiş G, iğneyi G'nin altındaki makro aynalara itmeyi önlemek için iğneyi çok uzağa sokmayın, sağ elinizdeki iğneyi, pipet ucu çekilmiş bir ağız pipeti ile değiştirin.

Pipetin ucunu G'deki deliğe yakın tutun ve çok nazik bir emme uygulayın. Embriyoyu forseps ile hafifçe sıkın, çünkü G'nin içeriği corion'dan dışarı itilir. Embriyonun engelsiz bir şekilde görülebilmesi için ağız pipetine çekin.

Embriyoyu dikkatlice izleyin. G çıkarıldıkça, G'nin kenarlığı corion'daki deliğe doğru çekilecek ve alttaki hücrelerin kesişimini görünür hale getirecektir. G'nin tamamı çıkarılana kadar baskı uygulamaya devam edin ve embriyoyu yuvarlamak için forsepsleri kullanın ve G'nin tamamının gittiğini görsel olarak onaylayın.

Bir mera pipeti kullanarak, embriyoyu filtrelenmiş yapay deniz suyuna, amfoterisin ve kalem streptokokuna aktarın. Enfeksiyonu önlemek için embriyodaki suyun yarısını günlük olarak değiştirin. İşte ablasyon öncesi ve sonrası bir embriyo.

Gördüğünüz gibi, G'nin daha önce olduğu yerde boş bir alan var. Hassas bir şekilde yapıldığında ve işlemden sonra embriyolara iyi bakıldığında, büyük bir yüzde yumurtadan çıkana kadar hayatta kalır. Laboratuvarımızda ortalama sağkalım oranı %50'nin biraz üzerindedir