הפוך מערכת דו היברידית שמרים לזהות יונקים הגרעיני קולטן שאריות כי אינטראקציה עם ligands ו / או יריבים

המטרה הכוללת של הליך זה היא לתאר תפוקה גבוהה של שמרים, שתי בדיקות היברידיות החושפות אינטראקציות בין קולטן Pregnan X או PXR לבין מעכב המולקולה הקטנה קטוקונזול. זה מושג על ידי בניית השמרים תחילה שני פלסמידים היברידיים, האחד מבטא את תחום הקישור של ליגנד P XR אנושי והשני מבטא את קולטן הסטרואידים. COACTIVATOR אחד או SRC נוכחות אחת של קטוקונזול משבשת את האינטראקציה של P XR אנושי עם SRC אחד כפי שנחשף על ידי מבחני בטא גלקטו נוזליים.

יחד עם סינון קולורמטרי של מושבות בסינון פילטר של מוטציות PXR בנוכחות קטוקונזול מאפשר זיהוי מוטציות ההופכות את הקולטן לחסין לפעולת התרופה, ובסופו של דבר ביטוי רופף על ידי בדיקה ויזואלית ותוצאות של בטא גלקטו נוזלי. מבחני SASE משמשים להצגת שינויים בהפעלת PXR בנוכחות קטוקונזול, המאפשר זיהוי שאריות מקוריות המעורבות באינטראקציה. הרעיון לשיטה זו עלה לראשונה במעבדה של ד"ר מני שבה אני עמית.

כאשר התמודדנו עם נתונים מובנים לא שלמים על PXR, הטכניקות הביוכימיות לא אפשרו לנו לבצע זיהוי, במיוחד עבור גודל האינטראקציה שהיו רדודים מאוד ולא ניתנים לתיקון בקלות. לבנות אפיון. בהתבסס על העיקרון של איתור מוטציות PXR עמידות לקיטון, הגענו לחומצה שתהיה ניתנת לביצוע, אפשרית וניתן לבצע אותה תוך ימים באופן תפוקה גבוהה מאוד.

למרות ששיטה זו יכולה לספק כוח פרמקלי-מקשר פנימי של מולקולות קטנות על חלבוני קולטנים, ניתן ליישם אותה גם על מערכות אחרות כגון כל חלבון שיש לו תפקיד פתוגני במחלות, במיוחד מגבלה אחת בביולוגיה של המבנה ניגשת לזיהוי גס מראש של שאריות כיפוף כדי להבין טוב יותר ולתכנן אינטראקציות מטרה מולקולריות קטנות. כדי להתחיל להגביר את תחום הקישור של ליגנד PXR אנושי ו-SRC אנושי באורך מלא כמתואר בפרוטוקול הטקסט. בדוק את מוצרי ה-PCR על ידי שימוש בג'ל 1%aros.

לאחר מכן, טהר את מוצרי ה-PCR מג'ל AROS. עכל את תוצרי ה-PCR בשני וקטורים היברידיים כמתואר בפרוטוקול הטקסט והנח את דגימות העיכול באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה. טהר את הדגימות המעוכלות מג'ל אגרוס של 1%, ולאחר מכן קשר את מוצרי ה-PCR המעוכלים והמטוהרים ושני וקטורים היברידיים לפני הפיכתם לחמישה תאים בעלי יכולת אלפא לאחר דגירה לילית ב-37 מעלות צלזיוס.

בחר את המושבות ובודד את עיכול אנזים ההגבלה של ה-DNA בפלזמה כדי לאשר את נוכחות הווקטור ולהכניס, לאמת את כל ה-DNA החיובי של הפלזמה על ידי ריצוף. חסנו את זן השמרים בחמישה מיליליטר YAPD ודגרו למשך הלילה על ידי תסיסה מתמדת ב-220 סל"ד ו-30 מעלות צלזיוס. למחרת בבוקר יש לחסן את השמרים 1 עד 20 בחמישה מיליליטר של YAPD ולדגור כדי לקבל צפיפות אופטית של 600 ננומטר של 0.2 על ידי צמחייה קבועה.

גלולה את התאים ב-2000 סל"ד במיקרו-צנטריפוגה למשך שתי דקות והשליכו את הסופרנטנט. לאחר מכן שטפו את הגלולה פעמיים במי חיטוי ופעם אחת עם 0.1 ליתיום אצטט מולארי. לאחר השלכת הסופרנטנט של השטיפה הסופית, הוסף את ריאגנטים הטרנספורמציה המפורטים בפרוטוקול הטקסט לכדור התא ולמערבולת כדי לערבב.

לאחר מכן הוסף את הווקטורים המכילים PXR ו-SRC המכילים לפני הערבוב. שוב, פיפטה את תערובת הטרנספורמציה לצינור תחתון עגול מפוליסטירן וערבב אותה למשך 30 דקות. העבירו את הצינור לאמבט מים של 42 מעלות צלזיוס ודגרו למשך 30 דקות נוספות.

לאחר מכן, צנטריפוגה את הצינור ב-2000 סל"ד למשך שתי דקות לאחר הסרת הסופרנטנט. שטפו את הגלולה פעם אחת עם פיפטת מים חיטוי 100 מיקרוליטר מים סטריליים לתוך הצינור והשעו מחדש את התאים על ידי הקשה עדינה באצבעות ופיפטינג. לאחר מכן צלחו את התאים על מדיום נשירה ללא היסטידין ולאוצין ודגרו בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך שלושה עד ארבעה ימים כדי לבודד טרנספורמציה.

כדי להתחיל בבדיקת מסנן Xga, חתוך משולש מקרום ניטרוצלולוזה כך שיתאים לחלק של 10 מילימטר של צלחת פטרי. סמן את קרום הניטרוצלולוזה כדי לסמן את הכיוון. הנח את קרום הניטרוצלולוזה המסומן מראש על מושבות השמרים וודא שהממברנה נמצאת במגע עם פני השטח של מדיום הצלחת.

הסר את הממברנה. הניחו אותו עם צד המושבה כלפי מעלה על נייר פילטר של שלושה מילימטר והניחו את הממברנה ואת נייר הסינון במינוס 80 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. לאחר מכן, הניחו שני עיגולים של נייר פילטר של שלושה מילימטר בצלחת פטרי והשרו אותם בחמישה מיליליטר תמיסת קסאל.

מסננים עודפי חיץ מצלחת הפטרי ומניחים את קרום הניטרוצלולוזה בצלחת כשצד המושבה כלפי מעלה. סגור את המכסה וודא שהממברנה יוצרת מגע מלא עם נייר הסינון והוא רטוב לחלוטין. עטפו את נייר הכסף של מהדורת פטרי ודגרו בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות כדי לגדל שמרים למשך הלילה ולהפיל מדיום נוזלי ללא היסטידין ולאוצין לצפיפות אופטית של 600 ננומטר של 0.7.

העבירו מיליליטר אחד של מדיום לצינור מיקרו צנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר וצנטריפוגה ב-3000 סל"ד למשך שתי דקות. לאחר השלכת הסופרנטנט, הוסף מיליליטר אחד של מאגר Z לכדור ולצנטריפוגה. כמו קודם, הוסף 150 מיקרוליטר של מאגר Z עם אתנול קפטו גידול כדי להשעות מחדש את גלולת התא.

לאחר מכן מוסיפים 50 מיקרוליטר כלורופורם ו -20 מיקרוליטר של 0.1% SDS במרץ. מערבולת את הדגימה למשך 15 שניות. לאחר מכן, ב-700 מיקרוליטר של תמיסת ONPG, כוונו את הטיימר ודגרו על 30 מעלות צלזיוס מספיק זמן כדי לאפשר לצבע הצהוב להתפתח.

לאחר התפתחות הצבע, שימו לב לזמן התגובה הכולל. הוסף 500 מיקרוליטר של נתרן פחמתי מולארי אחד כדי לעצור את התגובה. לאחר מכן קבע את הספיגה ב-420 ננומטר.

כשלב אחרון, חשב יחידות מילר כמתואר בפרוטוקול הטקסט. מכיוון שלשמרים יש ייצור סטרילי משמעותי, ניתן לגרום לביטוי רפוי בשמרים ללא צורך בליגנד אקסוגני נוסף. בדיקת הרמת ה-xal גילתה כי ביטוי רפוי כפי שמוצג על ידי המושבות הכחולות מושרה בזן השמרים שעבר טרנספורמציה עם PXR ו-SRC אחד.

זה מוצג גם בבדיקת נוזל הבטא גלאס. עם זאת, אין אינדוקציה של ביטוי רפוי בשמרים שעברו טרנספורמציה עם וקטורים ריקים PXR בלבד או SRC אחד בלבד. קטוקונזול משבש אינטראקציות P XR ו-SRC one בשמרים מכיוון שכל המושבות ממסנן ההעתק היו לבנות, מה שהוכח גם על ידי פעילות סאס בטא גלקטי מופחתת משמעותית על ידי מבחנים אנזימטיים נוזליים.

כאשר בוצעו טרנספורמציות שמרים עם S rrc אחד על המוטציה הכפולה P XR, זה גילה שהמושבות שנחשפו לקטוקונזול עדיין שומרות על ביטוי רפוי. זה דומה למחקרים קודמים במעבדה זו שהראו שאותו PXR יכול להיות מופעל על ידי ליגנד חזק, אך הוא חסין מפני ההשפעות האנטגוניסטיות של קטוקונזול במבחני יונקים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע זהירות והיכן ניתן הוא AC היברידי והשינויים הדרושים הנדרשים לחקר שאריות כיפוף מולקולאריות קטנות על חלבונים.

כאשר חשוב לנסות הליך זה לזכור להשיג ספרייה מגוונת ביותר של מוטציות של הקולטן שלך, להשיג יעילות טרנספורמציה טובה של כל 200 פלוסים, לפתח העתקים כמעט זהים של המסנן במקום עם או בלי תרופות, ולבסוף לבצע בדיקה ויזואלית וכימית מדויקת לזיהוי נבז. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו Ian 200 a Acids protein pro as acids and iCal docking homologous models על מנת לענות על שאלות נוספות כמו לפחות כיפוף uc הרלוונטי לתאים אנושיים חלבונים. ואם כן, האם ניתן לעשות מודל ההגנה הזו, שאריות זה כפרמקו עבור.