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Biology I: yeast, Drosophila and C. elegans

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C. elegans Ensaio de quimiotaxis

Overview

A quimiotaxis é um processo no qual células ou organismos se movem em resposta a um estímulo químico. Na natureza, a quimiotaxis é importante para que os organismos sentem e se movam em direção às fontes alimentares e se afastem de estímulos que possam ser tóxicos ou prejudiciais. A quimiotaxis também é importante no nível celular. Por exemplo, a quimitaxis é necessária para o movimento do esperma em direção a um óvulo antes da fertilização. No laboratório, a quimiotaxis é frequentemente examinada no nematode, C. elegans, que é conhecido por migrar para fontes de alimento no solo, mas longe de toxinas como metais pesados, substâncias com pH baixo e detergentes. Este vídeo demonstra como realizar um ensaio de quimiotaxis, que inclui preparar as placas de quimiotaxis e os worms, executar o ensaio e analisar os dados. Em seguida, discutimos exemplos de como os ensaios de quimiotaxis podem ser usados em C. elegans como uma ferramenta para entender o aprendizado e a memória, adaptação olfativa e doenças neurológicas como a doença de Alzheimer. Experimentos de quimiotaxis em C. elegans têm possibilidades quase ilimitadas de aprender mais sobre os mecanismos celulares e genéticos de muitos processos biológicos, e podem levar a uma maior compreensão da biologia humana, desenvolvimento e doenças.

Procedure

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O movimento de uma célula ou organismo em resposta a um estímulo químico é um comportamento chamado quimiotaxis. Neste vídeo, aprenderemos como realizar um ensaio de quimiotaxis usando o nematode, C. elegans. Também discutiremos como os ensaios de quimiotaxis em C. elegans são aplicados para estudar aprendizado e memória, adaptação olfativa e doença de Alzheimer.

Vamos primeiro discutir dois tipos diferentes de quimiotaxis. O movimento em direção a um estímulo químico é chamado de quimiotaxis positivos. Em contraste, o movimento longe de um estímulo químico é chamado de quimipetaxis negativos, permitindo que os organismos se afastem de produtos químicos nocivos.

A quimiotaxis pode ocorrer no nível do organismo, à medida que os organismos se movem em direção a uma fonte de alimento. A quimiotaxis também ocorre no nível celular, dentro dos organismos. Por exemplo, as células imunes migram em direção a patógenos ou locais de inflamação. Em outro exemplo, as células espermatozoides se movem em direção ao óvulo em resposta a um quimio-atrativo liberado pelo óvulo. A quimitaxis também é um processo importante durante o desenvolvimento, no qual as células migram em resposta a um estímulo químico, formando tecidos e órgãos no organismo em desenvolvimento.

Para c. elegans selvagens, que habitam o solo, a quimiotaxis é importante para a detecção e o movimento em direção às bactérias, sua principal fonte de alimento. Em contraste, os C. elegans são repelidos por metais pesados, substâncias com pH baixo, e detergentes, que são tóxicos para o organismo.

Os ensaios de quimiotaxis geralmente começam preparando placas de quimiotaxis. Usando uma régua e um marcador, divida uma placa de 5 cm com meio de crescimento nematoide em quatro quadrantes iguais. Em seguida, desenhe um círculo com um raio de 0,5 cm ao redor do centro do quadrante. Este será o ponto de partida para os vermes. Marque e rotule um ponto em cada quadrante, de tal forma que cada ponto seja equidistante do centro, e um do outro.

Ao preparar vermes para o ensaio, é fundamental usar vermes adultos jovens sincronizados de idade para que as diferenças na quimiotaxis não sejam um artefato do estágio de desenvolvimento. Uma vez sincronizados os worms, colete-os primeiro pipetting 2 ml de tampão S-basal em uma placa contendo adultos jovens. Gire e incline o prato para lavar os vermes da placa.

Em seguida, pipete a solução worm/S-basal em um tubo de microcentrifuuge. Lave os vermes centrifugando brevemente a solução worm/S-basal, removendo o supernatante e adicionando outro mililitro de solução S-basal à pelota de minhoca. Inverta o tubo e repita a lavagem mais duas vezes. Após a lavagem, remova todos, exceto aproximadamente 100 μl da solução S-basal. Em seguida, adicione 2 μl da mistura worm/S-basal a uma placa NGM. Usando um microscópio, conte o número de vermes presentes. Idealmente, haverá entre 50-250 vermes por 2 μl de S-basal.

Agora que as placas de quimiotaxis e os vermes estão prontos, podemos começar o ensaio de quimiotaxis. Primeiro, misture volumes iguais da sua solução de teste com 0,5 M de azida de sódio, um anestésico que irá paralisar os vermes assim que chegarem ao seu destino. Faça o mesmo com sua solução de controle. Em seguida, pipeta 2 μl de mistura worm/S-basal no centro da placa de quimioterapia. Em seguida, pipeta 2 μl da solução de teste ou controle e coloque em pontos devidamente rotulados na placa de quimioterapia. Uma vez absorvidas as soluções de teste e controle, coloque a tampa novamente, inverta a placa e reserve um temporizador por 1 hora.

Depois que os vermes tiverem uma hora para responder aos estímulos químicos na placa, os dados podem ser analisados. Conte manualmente o número de vermes dentro de cada quadrante. Se os vermes forem atraídos para o teste químico, haverá mais vermes presentes nesses quadrantes. Se forem neutros em relação a esse produto químico, os vermes estarão presentes em cada quadrante igualmente.

Use esses dados para calcular o índice quimotactic, que é o número de vermes nos quadrantes de teste menos o número de vermes no quadrante de controle, dividido pelo número total de vermes. Um índice quimotactic próximo a +1 sugere atração, enquanto um índice quimotactic próximo a -1 indica repulsa.

Agora que aprendemos a montar um ensaio de quimiotaxis, vamos dar uma olhada em como esses experimentos são aplicados para responder a perguntas científicas.

Uma das formas de fazer ensaios de quimiotaxis em C. elegans é para estudar a aprendizagem e a memória. Por exemplo, os vermes podem ser condicionados a associar um estímulo químico com uma fonte de alimento. Vermes bem alimentados estão famintos por uma hora, e então eles são condicionados com comida, bem como um produto químico como butanone.

Em seguida, os vermes são mantidos em um prato com comida, mas sem butanone. Executar um ensaio de quimioterapia determinará então se os vermes aprenderam a associar butanone com comida. Muitas variações deste experimento podem ser realizadas para determinar outras informações, como quais genes ou neurônios são importantes para o aprendizado e a memória.

A adaptação olfativa é um fenômeno que ocorre quando os neurônios sensoriais diminuem sua resposta a um estímulo ao longo do tempo, permitindo que o animal responda a outros estímulos, possivelmente mais importantes. Por exemplo, os tipos selvagens C. elegans expostos a um odor por um período de tempo, ignorarão esse odor durante um ensaio de quimioterapia devido à adaptação olfativa, em vez de serem atraídos por ele. Portanto, telas genéticas de alto rendimento podem ser realizadas para revelar os reguladores genéticos da adaptação olfativa, como o egl-4. Além disso, vermes transgênicos expressando proteínas fluorescentes marcadas podem ser observados para alterações na localização durante a adaptação olfativa.

Finalmente, os ensaios de quimiotaxis podem ser usados em C. elegans para estudar a doença de Alzheimer. Os cientistas podem expressar peptídeo beta amiloide masculino marcado fluorescente - uma marca registrada da doença de Alzheimer - nos neurônios de C. elegans. Curiosamente, ensaios de quimiotaxis revelaram que vermes expressando beta amiloide em uma população de neurônios mostram quimiotaxis reduzidas em relação a um quimio-atrativo em comparação com o controle. Muitas variações deste experimento poderiam ser realizadas, incluindo expressar beta amiloide em outras populações de neurônios ou tecidos, ou determinar se quaisquer compostos podem aliviar os efeitos da expressão beta amiloide, levando, em última instância, a uma terapia potencial.

Você acabou de assistir a introdução de JoVE à chemotaxis em C. elegans. Primeiro, definimos o que é quimiotaxis e por que é importante na natureza para organismos e células. Então demonstramos como realizar um ensaio de quimioterapia com C. elegans. Finalmente, discutimos como a quimiotaxis pode ser aplicada para entender o aprendizado e a memória, adaptação olfativa e doença de Alzheimer. Obrigado por assistir!

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