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Biology I: yeast, Drosophila and C. elegans

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Melanogaster drosophila Colheita e Preparação de Embriões e Larvas
 
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Melanogaster drosophila Colheita e Preparação de Embriões e Larvas

Overview

Embriões e larvas de melanogaster de Drosophila são fáceis de manipular e se desenvolver rapidamente por mecanismos análogos a outros organismos, incluindo mamíferos. Por essas razões, muitos pesquisadores utilizam embriões de moscas e larvas para responder a perguntas em diversos campos que vão do comportamento à biologia do desenvolvimento. Antes da experimentação, no entanto, os embriões e larvas devem primeiro ser coletados.

Este vídeo demonstrará primeiro como "copos de criação de ovos" são usados para coletar embriões de Drosophila em placas de ágar. A colheita e descorção de embriões serão então descritas. Em seguida, o vídeo demonstrará como identificar e manipular Drosophila em um dos três estágios larvais que seguem o estágio do embrião. Finalmente, são fornecidos exemplos de algumas das maneiras pelas quais embriões e larvas de moscas são usados em pesquisas biológicas.

Procedure

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Embriões e larvas de melanogaster de Drosophila são fáceis de manipular e seu desenvolvimento é guiado por mecanismos que existem em outros organismos, incluindo mamíferos. Aprender a colher e preparar embriões e larvas é um passo preliminar em muitos processos experimentais, desde a biologia comportamental até o desenvolvimento. Este vídeo abordará os métodos padrão de coleta e colheita de embriões e larvas de Drosophila, procedimentos essenciais no uso deste versátil organismo modelo.

O estudo do embrião de Drosophila forneceu uma grande visão da forma como os genes regulam o desenvolvimento, desde o mRNA expresso como um gradiente no oócito, até os genes que formam o plano corporal segmentado anterior a posterior. Alguns desses genes, como os genes da caixa de homeobox são altamente conservados entre este inseto e mamíferos.

A natureza saudável dos embriões de Drosophila permite que eles resistam à exposição a ambientes e produtos químicos severos, o que os torna extremamente práticos de estudar.

Após a fertilização, uma mosca fêmea pode colocar até 100 embriões por dia, que eclodirão em larvas após 12-15 horas.

Para manipular embriões de Drosophila, eles devem primeiro ser coletados.

Os embriões são coletados em câmaras de colocação de ovos muitas vezes referidas como "xícaras de colocação de ovos".

Para montar o copo de colocação, primeiro faça furos ou corte parte de um recipiente e cubra-o com material poroso para permitir a ventilação. Em seguida, obtenha uma placa de ágar de suco de maçã ou uva, listra-lo com pasta de levedura, e arranhar as placas no centro. A presença de pasta de levedura induzirá a colocação de ovos.

Adicione rapidamente moscas à câmara de colocação de ovos, inverta a câmara para que a placa fique na parte inferior, e deixe incubar. Após o tempo de incubação desejado inverta a câmara de ovos e bata-a no topo do banco algumas vezes. As moscas caem para o fundo e são brevemente desorientadas. Substitua rapidamente a placa de ágar antiga pela placa fresca em camadas com a pasta de levedura. Para adquirir os embriões mais envelhecidos troque as placas a cada 1-3 horas.

As placas terão centenas de embriões, especialmente perto dos arranhões e leveduras.

20 moscas de cada sexo devem produzir 100-200 embriões por hora. Agora os embriões podem ser colhidos.

As ferramentas necessárias para a colheita de embriões são um coador ou peneira, que pode variar muito em tamanho e complexidade, um pincel e água destilada.

Primeiro, solte os embriões imergindo a placa com água destilada, escovando suavemente a superfície com um pincel. Em seguida, filtrar o líquido despejando a mistura na peneira. Enxágüe os embriões com água.

A lavagem é frequentemente seguida pela descorionação — a remoção da membrana externa dura do embrião, ou chorão.

A descorção pode ser feita manualmente através de uma dissecção do embrião fora da baia coriônica. Alternativamente, os embriões podem ser colocados em 50% de alvejante. Leva de 2 a 10 minutos para o acorde se dissolver, como observado pelo desaparecimento dos apêndices dorsais. Enxágüe bem com água destilada para garantir que o embrião nu não seja danificado por alvejante. A descorção é um pré-requisito para técnicas como microinjeção e imagem de células vivas.

Agora que você tem uma sensação de biologia embrião, coleta e colheita, vamos passar para o próximo estágio no ciclo de vida de Drosophila: larvas.

As larvas de drosophila têm três estágios "instar", ou de fundidos. O primeiro instar dura um dia, o segundo outro dia, e o terceiro mais dois dias. Primeira e segunda larvas instar são encontradas na comida do frasco 1-3 dias depois de configurar uma cruz. No quarto dia, terceiras larvas instar migram para cima, ou "vagueiam" pelos lados do recipiente, onde finalmente formarão casulos chamados pupas.

Larvas são frequentemente usadas para experimentação por causa de seus discos imagináveis. Discos imagináveis são órgãos parcialmente desenvolvidos que são conhecidos por se tornarem partes inteiras da mosca adulta. Por exemplo, um disco de olho imaginável se tornará um olho adulto, discos antenas se tornarão antenas, e discos de asa imaginais se tornarão asas. O estudo de discos imagináveis levou a importantes descobertas em Drosophila, como o papel dos genes homeobox na formação de padrões.

A coleta de larvas é mais simples do que a coleta de embriões, pois não requer a transferência de moscas para habitação especial.

Larvas individuais podem ser removidas com pinças ou uma espátula. Ao coletar um grande número de larvas em estágio inicial, você pode empregar um método alternativo de coleta usando uma solução de sacarose, que é mais densa do que as larvas e faz com que elas flutuem.

Adicione a solução de sacarose ao frasco, que flutua larvas até o topo. Desaloja a comida colocando o frasco em um rotador. Em seguida, remova larvas com uma escova ou pipeta e colher para experimentos.

Agora que cobrimos técnicas de coleta e colheita de embriões e larvas, agora vamos ver como aplicá-las à experimentação.

Como são móveis, as larvas de Drosophila podem ser usadas para experimentos comportamentais.

Aqui você vê um "ensaio rastejante", que é usado para avaliar o comportamento locomotor de Drosophila em condições específicas. O ensaio rastejante mede a distância que a larva percorre, a fim de observar os efeitos de uma droga na função motora. As larvas coletadas estão imersas em uma solução de sacarose drogada que está prevista para interferir com a motilidade.

Microinjeção é um procedimento para criar moscas de frutas geneticamente modificadas, conhecidas como mutantes transgênicos, inserindo material genético personalizado na forma de um plasmídeo de DNA circular.

Esses embriões são descorioados por enrolar fisicamente em fita dupla face para que os produtos químicos não os danifiquem. Embriões podem então ser injetados com plasmídeos que codificam proteínas, como tubulina, fundidas com proteínas fluorescentes de repórteres, como a GFP. Experimentos podem então ser realizados para visualizar processos celulares como mitose de linhas de mosca transgênicas estabelecidas.

Embriões podem ser usados para visualizar a presença de transcrições através da hibridização fluorescente in situ.

Neste experimento, embriões inteiros são observados para a presença de uma transcrição mRNA desejada via microscopia de fluorescência. Os embriões são fixados usando uma solução bifásica que deschorionatos e, portanto, prepara o embrião para coloração. Os embriões nus estão na camada inferior. Após a coloração imunofluorescente, a presença da proteína desejada pode ser vista usando microscopia de fluorescência.

Você acabou de assistir o vídeo de colheita e preparação de embriões e larvas do JoVE. Revisamos a coleta, colheita e preparação de embriões e larvas e algumas aplicações importantes aplicadas aos organismos em estágio inicial. Obrigado por assistir!

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