Sıtma Sivrisineklerinde 2D ve 3D Kromozom Boyama

Bu prosedürün genel amacı, doğrudan balık deneyleri için kullanılmak üzere tek bir mikro diseke politan kromozom kolundan yeterli DNA amplikonu üretmektir. Bu, önce mikro diseksiyon için özel olarak tasarlanmış membran slaytları üzerinde politan kromozom kabaklarının hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. İşlemin ikinci adımı, lazer mikro diseksiyon ile tek tek politan kromozom kollarını izole etmek ve yakalamaktır.

Üçüncü adım, mikro diseke edilmiş numuneden DNA'yı izole etmek ve iki tur tam genom amplifikasyonu kullanarak DNA'yı amplifiye etmektir. Son adımlar, çoğaltılmış DNA'yı etiketlemek ve bunları balık deneylerinde kullanmaktır. Sonuç olarak, sonuçlar, ilgilenilen bir bölge için bol miktarda floresan, etiketli DNA verebilir.

Bu tekniğin, sırt klonları veya PCR fragmanları olan balıklar gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, kromozomların büyük bölümlerinin bu etiketli problarla floresan olarak boyanabilmesidir. Ayrıca, sağlam kromozom kollarından mekanik olarak izole edildikleri için kromozom boyaları için herhangi bir dizinin bilinmesine gerek yoktur. İlk olarak, bu durumda kromozomları, taze araba gürültüsü çözeltisine sabitlenmiş yaklaşık beş sivrisineğin yumurtalıklarından izole edin.

İyi bir kromozom yayılımı doğrulandıktan sonra, kromozomlar denatürasyon ile düzleştirilir, ardından soğuk gece inkübasyonu yapılır. Ertesi gün, kromozomlar kurutulur ve mikrodiseksiyona hazırlanmak için yıkanır. Mikrodiseksiyon kapsamını etanol ile temizlediğinizden ve eldivenleri ve tüpleri uv ile sterilize ettiğinizden emin olun.

Ardından, metin protokolünde sağlanan ikincil bir videoyu izleyerek kromozomları mikrodiseke edin. Ters çevrilmiş bir tüpü yerleştirmek için bir modifikasyona sahip bir kojen kiti kullanarak DNA'yı toplayın. Bunu sütun saflaştırma ve suya elüsyon ile takip edin.

Tek bir kromozom kolunun tüm genom amplifikasyonu için iki yol vardır. Ley g kökü başlangıçta daha büyük bir verim sağlar, ancak DNA'yı etiketlemek için NIC translasyonu gerektirir. Genom plex kökü, birden fazla replikasyon turuna izin vermenin yanı sıra nihai sonuç problarının doğrudan etiketlenmesine izin vermenin avantajı olarak.

Kirleticilerin amplifikasyonu kuvvetle muhtemel olduğundan, mümkün olan en steril koşulları kullandığınızdan emin olun. Genom plex kökü için İlk olarak, tek hücreli WGA dört kitinin ilk amplifiye DNA partisini üretmesine izin verin. İkinci olarak, genom temizleme ve yoğunlaştırıcı kitini kullanarak DNA'yı saflaştırın.

Yıkama DNA'sını TE tamponu değil su kullanarak elüte etmeyi unutmayın. Üçüncüsü, DNA'yı şeyleştirin ve dördüncüsü her iki adımda da balıklar için etiketleyin. WGA üç yeniden amplifikasyon kitini kullanın.

DNA'nın etiketlenmesi, etiketli DUTP'nin yanı sıra belirli bir nükleotid oranını içeren özel bir DNTP karışımının kullanılmasını gerektirir. Rege kitini çalıştırırken, root ilk olarak taze sterilize edilmiş su kullanarak tek hücreli WGA kitini kullandı ve yakın zamanda D iki tampon yaptı. Ardından, amplifiye edilmiş DNA'yı etiketlemek için NIC çeviri protokolünü izleyin.

Bir jel üzerindeki DNA parçası boyutunu kontrol ettiğinizden emin olun. Parçalar yaklaşık 200 ila 500 baz çifti olmalıdır. Her iki kök etanolü de bitirmek için, etiket DNA'sını çökeltin ve numuneyi 10 dakika boyunca dört santigrat derecede santrifüjleyin.

Daha sonra geri kazanılan peleti havayla kurutun ve 40 mikrolitre hibridizasyon tamponu ekleyin. Önceden kuruduktan sonra, kapak fişlerinin üzerine dayanacağı kare duvarlı oje duvarlı slaytlar hazırlayın, böylece çekirdekler kapak astarı tarafından ezilmeyecektir. Şimdi Christopher'ın üçüncü aşaması olan yarı mezar dişi sivrisineklerden taze yumurtalıkları inceleyin.

Yumurtalıkları 150 ila 250 mikrolitre tamponlu bir tüpe aktarın, tüpte artı% 0.5 basamak toin. Foliküler zarları yok etmek için büyük bir diseksiyon iğnesi kullanın. Daha sonra folikülleri daha fazla rahatsız etmek için tüpü beş ila 10 dakika boyunca girdaplayın.

Büyük foliküler parçaları kazıyın ve tüpü düşük hızda, yaklaşık 500 RPM'de 30 saniye santrifüjleyin. Süpernatanları yeni bir tüpe aktarın ve parçalanmış folikülleri içeren orijinal tüpe 100 mikrolitre tampon A ekleyin. Şimdi, görünür doku sadece küçük parçacıklar olana kadar parçalanmış foliküller üzerinde nükleer izolasyon adımlarını tekrarlayın.

Tüm süpernatları aynı tüpte toplayın, çünkü hepsi çoğunlukla çekirdek içerecektir. Daha sonra, süpernatı içeren tüpü ve kalan dokuyu içeren tüpü aşağı doğru döndürün, bu bir koruma olarak işlenir. Supernat'ı atın ve %0.1 Triton ile 200 mikrolitre tampon A ekleyin, peletler parçalanana kadar tüpleri kuvvetlice girdap yapın ve ardından numuneleri gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin.

Ertesi gün, tüpleri 10.000 RPM'de beş dakika santrifüjleyin, süpernatanları çıkarın ve PBS'ye 200 mikrolitre% 4 paraform aldehit ekleyin. Daha sonra tüpleri bir termo karıştırıcıda 30 dakika inkübe edin ve 450 RPM'de karıştırın. 5.000 RPM'de beş dakikalık bir dönüş kullanarak sabitleyiciyi çıkarın ve ardından süper isimleri atın.

Daha sonra% 0.1 Triton ile tampon A ekleyin ve tüpleri 450 RPM santrifüjde bir termo karıştırıcıda beş dakika inkübe edin, yıkama hücreleri beş dakika daha inkübe edin. 5.000 RPM'de, etiketli probu 37 santigrat dereceye kadar ısıtmaya hazır hale getirin. Hücreler peletlendiğinde, süper isimleri en az 20 mikrolitre etiketli prob ile değiştirin.

Konsantrasyonu konusunda endişelenmeyin. Daha sonra, DNA'yı Thermo karıştırıcıda 450 RPM'de 10 dakika boyunca 95 santigrat derecede denatüre edin ve sürekli karıştırma ile 15 dakika boyunca 80 santigrat derecede denatürasyona devam edin. Ardından sıcaklığı 37 santigrat dereceye düşürün ve numuneyi gece boyunca karıştırmaya devam edin.

Ertesi gün, beş dakika santrifüj ederek çekirdekleri geri kazanın. 5.000 RPM 2, 655 Gs'de SUPERNAT'ı %0.1 tritton içeren bir tampon yıkama ile değiştirin. Hücrelerin oda sıcaklığında yaklaşık 500 RPM'de çalkalama ile beş dakika yıkanmasına izin verin.

Yıkamayı başka bir santrifüjle çıkarın ve yıkama işlemini iki kez daha tekrarlayın. Üçüncü yıkamayı çıkardıktan sonra, çekirdekleri doğrudan DPI ile uzun süreli bir anti solmaya yeniden süspanse edin. Çekirdekleri dikkatli bir şekilde aktararak, kabarcıklardan kaçınarak hazırlanmış bir slayta geçin ve bir kapak kayması, genom plex ve ee uygulayın.

Tek hücreli WGA kitlerinin her ikisi de sivrisinek dokusunda tarif edildiği gibi kullanıldı. Elde edilen DNA, jel elektroforezi ile karşılaştırıldı. Açıkçası, verim önemli ölçüde değişti ve bu da spektroskopi ile doğrulandı.

Balık, sivrisinek politan kromozomları üzerinde mikro disseke materyal için beş prob kullanılarak gerçekleştirildi. Dört otozom alarmı, WGA üç kiti kullanılarak üç floro dörtlü ile etiketlendi. Üç R kromozomu yeşil floresein ile etiketlenmiştir.

Üç L kromozomu kırmızı ve sarı karışımıdır. İki R kromozomu sarı renktedir ve iki L kromozomu kırmızı renktedir. X kromozomu, ley G materyalinin NIC translasyonu ve politan ve mitotik kromozom kollarının e kromatik kısımları arasındaki yazışmayı kurmak için ayrı bir deney kullanılarak turuncu renkte etiketlendi.

Kromozom boyaları, interfaz kromozomlarına hibridize edildi. İki R kolu yeşil renkle etiketlenmiştir. Üç R kolu pembe renktedir ve üç L kolu turuncu renktedir.

Kromatinin DPI ile mavi renkte boyandığı profaz kromozomları gözlenmiştir. X kromozomu, 18 S-R-D-N-A probuna karşılık gelen kırmızı bir etikete sahiptir, Pro metafaz kromozomları daha sonra görüntülendi. Metafaz kromozomları da bulundu.

Parlak mavi lekeli bölgeler, hücre çekirdeğindeki tek bir politan kromozom kolunun 3 boyutlu organizasyonunu görselleştirmek için heterokromatine karşılık gelir. Bütün mount balığı sue suşunda gerçekleştirildi. Sivrisinek yumurtalık hemşire hücreleri kromozom kol bölgeleri politan kromozomlar üzerinde net olarak görülür.

Benzer şekilde, arayüzdeki çekirdeklerde farklı kromozom kol bölgeleri açıkça görülür. Bu prosedüre katılırken, tüm adımların kontaminasyon riskleri göz önünde bulundurularak gerçekleştirilmesi önemlidir. Numuneleri kontamine etmek çok kolaydır ve bu da amaçlanan DNA'nın düşük amplifikasyon verimine neden olur.