Otomatik kullanarak Kromozomlar Yüksek throughput Fiziksel Haritalama In situ Hibridizasyon

Bu prosedürün genel amacı, yüksek basınçlı bir kromozom hazırlığı kullanarak DNA problarını sivrisinek politan kromozomlarına eşlemek, ardından C iki hibridizasyonunda otomatik floresan ve otomatik görüntülemedir. Bu, önce yüksek basınçlı bir yöntem kullanılarak politan kromozom yayılımlarının hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. Prosedürün bir sonraki adımı, bir Nick çeviri protokolü kullanarak genomik arka DNA'yı florokrom ile etiketleyerek floresan problar hazırlamaktır.

Üçüncü adım, otomatik slayt boyama sistemleri kullanarak C iki hibridizasyonunda floresan gerçekleştirmektir. Son adım, otomatik bir floresan görüntüleme sistemi kullanarak etiketli kromozomları taramak ve fotoğraflamaktır. Sonuç olarak, görüntüler, poli kromozom üzerinde floresan olarak işaretlenmiş bir DNA probunun lokalizasyonunu gösterebilir.

Bu tekniğin veya standart bir manuel yerinde hibridizasyon protokolü gibi mevcut yöntemlerin ana avantajı, en yüksek verimli fiziksel haritalama protokolünün daha tutarlı sonuçlar üretmesi ve uygulamalı süreyi önemli ölçüde azaltmasıdır. Bu protokol, Christopher'ın üçüncü evresindeyken yumurtalıklarını toplamak için kan beslemesinden yaklaşık 25 saat sonra yarı yerçekimi ve oly dişilerini inceleyerek başlar. Bu aşamada, foliküller içindeki hemşire hücrelerinin bulunduğu şeffaf alan yuvarlak bir şekle sahip olmalı, beş dişiden yumurtalıklar toplamalı ve bunları 500 mikrolitre yeni yapılmış modifiye araba gürültüsü solüsyonuna sabitlemelidir.

Daha sonra oda sıcaklığında 24 saate kadar veya eksi 20 santigrat derecede daha uzun süre saklanabilirler. Daha sonra, yumurtalık diseksiyon slaytları yapmadan hemen önce, araba gürültüsü çözeltisi ve% 50 propiyonik asit hazırlayın. Her bir yumurtalık çiftini, diseksiyon mikroskobu altında tozsuz bir slayt üzerine bir damla taze araba gürültüsü solüsyonuna yerleştirin.

Yumurtalıkları diseksiyon iğnesi ile bölün. Tüm yumurtalık parçalarını %50 propiyonik asit içeren altı temiz slayta aktarın. Diseksiyon iğneleri kullanarak folikülleri birbirinden ayırın.

Ardından kalan dokuları bir kağıt havluyla silin. Bir damla daha %50 proponik asit ekleyin ve üç ila beş dakika bekleyin. Efsaneye göre, foliküller üç ila beş dakika boyunca% 50 Proponik asit içinde oturur, kromozom yayılımını önemli ölçüde iyileştirir.

Ardından, bir kapak fişi uygulayın ve çekirdekleri yaymak için bir dakika daha bekleyin. Slaytı filtre kağıdı ve plastikle sarın. Bir Dremel'i üç ile 5.000 RPM arasında ayarlayın ve yaklaşık bir dakika boyunca dönen bir dremel ucunu kapak kızağına doğru hafifçe döndürün.

Yayılma kalitesini bir faz mikroskobu ile onaylayın ve gerekirse kromozomları düzleştirmek için dremel'i daha uzun süre uygulayın. Birincinin yanına ikinci bir kapak fişi yerleştirin, ardından kapak fişlerini başka bir mikroskopla sandviçleyin. Sonraki kaydırın, slaytları plastik bir tabaka ile sarın ve filtre kağıdı ile sarın, slaytları 85 ila 120 inç pound arasında sıkmak için sargı slaytlarını bir mengeneye yerleştirin.

Altı slaytın tümünde kromozomları düzleştirdikten sonra, slaytları açın ve kromozomları daha da düzleştirmek için fazla slaytları çıkarın. Slaytları 55 santigrat derecede bir slayt denatürasyon hibridizasyon sisteminde 10 ila 15 dakika inkübe edin. Ardından, bir slaytı en az 15 saniye veya kabarcıklanma durana kadar sıvı nitrojene batırın.

Ardından kapak fişini bir tıraş bıçağıyla hızlı bir şekilde çıkarın ve sürgüyü hemen beş dakika boyunca soğuk, %50 etanol içine yerleştirin. Bu işlemi her slayt için sırayla yineleyin. Slaytları %70, %90 ve %100 etanol banyosunda kurutun.

Onları beş dakika boyunca her banyoya daldırın. Son olarak, slaytlar hava kuruduktan sonra, lekelenme için balıklara hazır hale gelirler. Otomatik bir cihaz, prob etiketleme dışında prosedürdeki adımların çoğunu gerçekleştirir.

Bu nedenle, cihazı yüklemeden önce, prob hazırlanmış olarak ticari bir NIC çeviri protokolü kullanarak DNA'yı florokrom ile geri etiketleyerek floresan probu hazırlayın, slaytları ve reaktifleri otomatik slaytlara yükleyin. Boyama sistemi ve aşağıdaki adımları gerçekleştirmek için sistemi programlayın. İlk olarak, 20 dakika boyunca 800 mikrolitre bir XPBS sağlayın.

İkinci olarak, slaytları kurutun. Üçüncüsü, slaytları bir dakika boyunca bir XPBS'de 450 mikrolitre% 4 formalin ile sabitleyin. Daha sonra slaytları bir saniye, iki kez ve iki dakika% 100 etanol ile yıkayın.

Etanol banyosundan bir kez sonra, slaytları tekrar kurutun. Şimdi kabarcıklanmayı önlemek için slaytları 45 santigrat derecede iki dakika ısıtın. Daha sonra 20 mikrolitre DNA probu uygulayın, ardından bir damla mineral yağ ve doğada bir kapak kayması, kromozomlar 10 dakika boyunca 90 santigrat derecede uygulayın.

Ardından slaytları 14 saat boyunca 42 santigrat derecede hibritleşecek şekilde ayarlayın. Hibridizasyon ayarından sonra, sertlik 42 santigrat derecede iki dakika boyunca yıkanır, ardından iki XSSC'nin art arda dört saniyelik uygulaması ve kurutma yapılır. Daha sonra iki kez 10 dakika boyunca 42 santigrat derecede 800 mikrolitre 0.4 XSSC uygulayın, ardından bir yıkama daha yapın ve 10 dakika boyunca 25 santigrat derecede iki XSSC uygulayın.

Şimdi lekeyi uygulayın, 50 mikrolitre yo-yo bir, ardından mineral yağ ve örtü astarları. Slaytları 25 santigrat derecede 10 dakika inkübe edin. Ardından kapak fişlerini çıkarın.

Slaytları iki XSSC'de yıkama başına bir saniye boyunca dört kez yıkayın ve slaytları kurulayın. Son olarak, her slayta 15 mikrolitre uzun süreli altın solma önleyici reaktif uygulayın ve yeni kapak fişleri takın. Halojen ampul için Olympus U-R-F-L-T güç kaynağından başlayarak Accord plus otomatik tarama sistemini güçlendirin.

Sonra bilgisayar ve son olarak kamera eki olan mikroskop. Şimdi önce düet yazılım paketini açın, 10 x ön tarama ayarlayın. Çevrimiçi düğmesine tıklayın, yeni bir servis talebi kimliği girin ve bir slayt kimliği atayın.

bf etiketli noktayı tıklayın. Bu, parlak alan seçeneğidir. 10 x ön tarama için bir tarama seçeneği seçin.

2.500 x daire, 10.000 x daire veya dikdörtgen seçin. Ayarla'ya tıklayın ve çalıştırın. Ardından, tamam, taramayı düzgün bir şekilde ayarlamak için istemleri izleyin ve ardından bitir'i tıklayın.

Taramayı başlatmak için, ana ekrana geri dönmek için ana sekmeye basın. Şimdi çevrimdışı düğmesine tıklayın, atanan vaka kimliğini ve slayt kimliğini bulun. Ve çevrimdışı'yı tıklayın.

Sol üst alandaki kara kutuda tarayın. Bir oka tıklayın ve 10 x ön taramayı seçin. İlgilendiğiniz bir görüntüyü bulduktan sonra taranan görüntüler arasında gezinmek için okları kullanın.

Hedeflenen bölgenin ortasındaki ekrana çift tıklayın ve snap tuşuna basın. Bu, tüm hedefleri seçtikten sonra daha sonra yakalanmak üzere bir görüntüyü hedefleyecektir. Her bir resme sağ tıklayın, sınıflandır'a tıklayın, 10 x ön taramayı seçin ve politan'ı seçin.

Ana menüye dönün ve 40 x ön taramayı ayarlayın. Tekrar çevrimiçi'ni seçin ve bir slayt seçin. BF'yi ffl olarak değiştirin ve görev adını tire X 40 dash rg'yi yeniden ziyaret edecek şekilde değiştirin.

Tümünü kısa çizgiye tekrar ziyaret etmek için son ayarın hemen altındaki bölümü değiştirin. Ardından programı çalıştırın ve istemleri izleyin. Otomasyonu ayarlamak için, 10 x ve 40 x görüntüleri eşleştirmek için görünümleri eşleştirmeye başla düğmesini tıklayın.

Taramayı başlatmak için bitir'e tıklayın. İşiniz bittiğinde, sınıflandır'ı tıklayın ve resimlere bakın. Kadın anomalisi Gambiya'dan alınan yumurtalık hemşire hücresi politan kromozomlarının preparasyonları yüksek basınç tekniği kullanılarak yapıldı.

Bu yöntem kromozom yapısının çoğuna zarar vermez veya değiştirmez. Bükülmüş kromozomları düzleştirir ve böylece düzenli preparatlarda görülmeyen gizli ince bantları ortaya çıkarır. Kromozom, S Gambiya ve Tam anomali kütüphanesinden elde edilen arka DNA klonları ile incelendi.

Kütüphane, ilk olarak anomali S Gambiya haşere suşunun yıldız larvalarında erkek ve dişiden üretildi. Bu prosedürü takiben, kromozom tabanlı genom düzeneklerinin hızlı bir şekilde geliştirilmesini kolaylaştırmak için otomatik bir yüksek verimli fiziksel haritalama gerçekleştirilebilir.