Fluoreszenz-basierte Überwachung von PAD4 Aktivität über eine Pro-Fluoreszenz Substratanalogon

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, quantitative Informationen über das Aktivitätsniveau von pad vier in einem leicht zu reproduzierenden Assay mittels Fluoreszenz zu erhalten. Dies wird durch Inkubation von Pad vier mit dem Designsubstrat Analogon ZR Co. erreicht. Das Protein wird entweder bei Raumtemperatur oder 37 Grad Celsius inkubiert, um die Umwandlung des Argininderivats in das Citralinprodukt zu ermöglichen, was zu einer kovalenten Modifikation des Substrats führt. Als nächstes wird der Lösung Trypsin zugesetzt, um die Fluoreszenzsignaldifferenz zu erzeugen.

Die Ergebnisse zeigen, dass die Zugabe von aktivem Pad vier zu einer Lösung, die das prof. Fluoreszierende Substrat enthält, zu einer kovalenten Veränderung führt, die auf seiner verminderten Empfindlichkeit gegenüber Trypsin und damit den niedrigeren Fluoreszenzsignalen noles basiert. Der Hauptvorteil unserer Technik gegenüber bestehenden Techniken, wie z. B. derjenigen, die sich mit der Freisetzung des flüchtigen Ammoniak-Nebenprodukts befasst, besteht darin, dass wir die Modifikation des Substrats durch Fluoreszenz überwachen.

Mary Saki und Jonathan Fiera für mein Labor werden diese Technik demonstrieren: Um mit Pad vier zu arbeiten, transformieren Sie zunächst das pgx-Plasmid, das die Pad 4G ST-Fusion enthält, in chemisch kompetente E-Coli-Zellen für die Expression von Pad 4-Proteinen aller Zellen auf Eis. Zweitens mischen Sie die dritten Zellen mit einem Mikroliter des PGX-Plasmids, das das Pad-4-Gen in einem Fünf-Milliliter-Kulturröhrchen enthält. Inkubieren Sie die Mischung 10 Minuten lang auf Eis und schütteln Sie sie alle zwei Minuten vorsichtig.

Dann schocken sie die Zellen jeweils 40 Sekunden lang bei 42 Grad Celsius. Unmittelbar danach wird das Zellplasmidgemisch für zwei Minuten wieder auf Eis gelegt, damit sich die Zellen erholen können. Fügen Sie nun einen Milliliter steriles LB hinzu und halten Sie die Zellen eine weitere Minute lang gekühlt.

Inkubieren Sie die Zellen anschließend eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius. Lassen Sie sie nach der Inkubation bei 250 U/min schütteln, pipettieren Sie 75 Mikroliter der transformierten Zellen auf eine Ampicillin-resistente Agarplatte und inkubieren Sie die Platte 15 Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Lagern Sie diese Platte bei vier Grad Celsius.

Übertragen Sie eine Kolonie von Transformationszellen auf fünf Milliliter LB, die Ampicillin enthalten. Legen Sie das Röhrchen in einen Inkubator und schütteln Sie es über Nacht bei 37 Grad Celsius. Am nächsten Tag.

Übertragen Sie die fünf Milliliter Starterkultur auf einen Liter STO L LB, der ein x Ampicillin Tri enthält. Überwachen Sie den OD 600 der Zellen, während sie bei 37 Grad Celsius wachsen. Wenn ihre Absorption 0,3 erreicht.

Den Kolben in einen 16 Grad Celsius warmen Raum stellen und weiter schütteln. Überwachen Sie weiterhin den OD des Wachstums. Wenn die OD der Kultur 0,6 erreicht.

Induzieren Sie die Zellen mit 0,3 millimolar Isopropyl THAG GTO. Lassen Sie die Zellen 15 Stunden lang bei 16 Grad Celsius zittern. Es ist wichtig, sicherzustellen, dass die Wachstumstemperatur bei 16 Grad Celsius liegt, bevor die Induktion mit IPTG eingeleitet wird.

Am nächsten Tag werden die Zellen durch Zentrifugation bei 4.000 G für 20 Minuten bei null Grad Celsius oder ohne SUP-Mittel angeboten und das Zellpellet bei minus 80 Grad Celsius gelagert, um das Pad zu sammeln. Vier Proteine resuspendieren das transformierte Zellpellet in einem Puffer, der EOL-Phenol, Methyl-Suen-Fluorid und Dihi drei ETOL enthält. Als nächstes werden die Zellen 15 Minuten lang bei vier Grad Celsius beschallt, nach der Beschallung zentrifugiert, die Lysate 20 Minuten lang bei 20.000 mal G und bei null Grad Celsius zentrifugiert.

Sammeln Sie das Supinat und inkubieren Sie es 30 Minuten lang bei vier Grad Celsius mit Glutathion-Aeros-Kügelchen. Lassen Sie das Supinat aus den GST-Kügelchen durch die Schwerkraft ab, nachdem sich der Durchfluss angesammelt hat. Waschen Sie die Kügelchen viermal mit 25 Millilitern PBS bei vier Grad Celsius.

Eluieren Sie dann das Protein von Pad vier aus den Kügelchen unter Verwendung von 10 Millilitern elucianischem Pufferpuffer und das Konzentrat von Pad vier im elucianischen Puffer unter Verwendung von Zentrifugenröhrchen mit 100 K Molekulargewicht. Schließlich wird Eloqua das gereinigte Pad-4-Protein in 200-Mikroliter-Volumina für die Lagerung bei minus 80 Grad Celsius überführt. Bereiten Sie für dieses Verfahren 83 mikromolare Arbeitslösung der mit ZR co-markierten Lösung A vor. Bereiten Sie auch die Lösungen B, D und die Pad-Lösung mit vier Lösungen vor C.In Bereiten Sie Lösung E vor, mischen Sie unbedingt, bis sich das TRIPSIN auflöst.

Besorgen Sie sich eine 384-Well-Platte, und bezeichnen Sie den Notizblock, vier Kontroll-Wells, die Test-Wells und die Inhibitions-Wells für Pad vier plus Chloramadin. Geben Sie dann 25 Mikroliter Lösung C in jede Testvertiefung und 25 Mikroliter D in jede Kontrollvertiefung. Die Platte 20 Minuten bei Raumtemperatur gut inkubieren.

Geben Sie nach 20 Minuten 10 Mikroliter Lösung B in die Hemmvertiefungen und warten Sie weitere 20 Minuten. Geben Sie als Nächstes 15 Mikroliter Lösung A in alle Vertiefungen. Warten Sie dann 45 Minuten.

Geben Sie nach 45 Minuten 10 Mikroliter Lösung E in alle Vertiefungen und warten Sie weitere 10 Minuten, bevor Sie Fluoreszenzmessungen durchführen. Verwenden Sie abschließend ein multimodales Lesegerät, um die Emissionsdaten zu erfassen. Zar CO wurde mit und ohne Pad vier für 45 Minuten ohne Pad vier inkubiert, die Zugabe von tripsin frei, die Fluor- und Fluoreszenzspiegel steigen an und das Vorhandensein von Pad vier Zar wird modifiziert und Trypsin setzt das Fluor nicht frei, wodurch die Fluoreszenz verringert wird.

Der Assay wurde in Well-Platten mit hoher Dichte bei Raumtemperatur getestet, um Hochdurchsatz-Screening-Verfahren bei Raumtemperatur zu ermöglichen. Die Signale waren im Vergleich zu denen, die bei 37 Grad Celsius erhalten wurden, praktisch unverändert. Bei Raumtemperatur verlief die Reaktion langsamer.

Es war innerhalb von 45 Minuten abgeschlossen. Die Stabilität des PED vier im Reaktionspuffer wurde dann über einen Zeitraum von 15 Stunden als hohe Stabilität getestet, die für ein Hochdurchsatz-Screening wichtig ist. Es wurde kein enzymatischer Aktivitätsverlust festgestellt.

Die Hemmung von PLA vier mit Chlor AMADINE zeigt die erwarteten Trends unter diesen Testbedingungen bei Raumtemperatur. Um die Robustheit des PAD four zku-Assays in Frage zu stellen, wurde er verwendet, um ein rohes Zelllysat von E-Coli-Zellen zu testen, die GST pad vier exprimieren. Beim Test unter den gleichen Bedingungen wie bei gereinigtem GST-Pad wurde wie erwartet eine Fluoreszenz von vier beobachtet.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie aktives Pad vier exprimieren und seine Aktivität mit diesem einfachen und zuverlässigen fluoreszenzbasierten Assay unter Verwendung eines Prof-Fluoreszenzsubstrats überwachen.