LC-MS / MS kullanarak Kurutulmuş Kan Spotlar Immünosupresan Tacrolimus Niceleme

Aşağıdaki deneyin genel amacı, kurumuş kan lekelerinde takrolimusun miktarını belirlemektir. Bu tekniğin, IV kan alımından sonra kan örneklerinde takrolimus miktarının belirlenmesine göre ana avantajı, hastaların örnekleri kendilerinin toplayabilmesidir: minimal invaziv, kurutulmuş kan lekeleri gibi düşük hacimli örnek toplama stratejileri ayrıca küçük çocuklarda terapötik ilaç izlemeyi ve farmakokinetik çalışmaları kolaylaştırır. Basit bir parmak çubuğundan sonra, hasta özel bir filtre kağıt kartında bir kan damlası toplar ve kan lekesi kurutulduktan sonra, takrolimus ve hastanın alabileceği diğer immünosupresanların analizi için merkezi bir laboratuvara postalanabilir.

Kurumuş kan lekeleri üzerindeki ilaçların miktar tayini, kurumuş kan lekeleri gibi çok küçük kan hacimlerinde takrolimus ve diğer immünosupresanların miktar tayini için oldukça hassas ve spesifik LCM SM S testlerinin geliştirilmesi sayesinde mümkün hale gelmiştir. İlk olarak, takrolimus için mililitre başına bir miligram konsantrasyonda ve mililitre başına 10 mikrogram konsantrasyonda saf metanol içinde stok çözeltileri hazırlayın. D iki 13 C alikot stok çözeltisi için ve her ekstraksiyon gününde eksi 70 santigrat derece veya altında saklayın, proteinleri çökeltmek ve takrolimi çıkarmak için suda yedi ila üç oranında metanol ve 0.2 molar çinko sülfat hazırlayın.

Dahili standart stok çözeltisi, çökeltme çözeltisine çivilenir. Çözeltinin sona erme tarihini 12 saat olarak ayarlayın. Bunu takiben, kalibratörler ve kalite kontrol numuneleri hazırlamak için saf metanol kullanarak stok çözeltisinin uygun seyreltmesini gerçekleştirerek takrolimus stok çözeltilerini hazırlayın.

Uygun şekilde seyreltilmiş stok çözeltisinden 20 mikrolitre EDT'ye dökün. Bir tam kan, takrolimusun hücresel kan bileşenlerine homojen bir şekilde dağılmasını sağlamak için bir su banyosunda 20 dakika boyunca hafifçe çalkalama altında 37 santigrat derecede inkübe edilir. Daha fazla miktarda kalibratör ve kalite kontrol numunesi hazırlamak için, uygun şekilde seyreltilmiş stok çözeltisinden 2000 mikrolitre EDT'ye dökün.

Bir tam kan, takrolimusun hücresel kan bileşenlerine homojen bir şekilde dağılmasını sağlamak için bir su banyosunda 20 dakika boyunca hafifçe çalkalama altında 37 santigrat derecede inkübe edilir. Daha sonra numuneleri konik tabanlı ve geçmeli kapaklı 1,5 mililitrelik polipropilen tüplere ayırın. Kan lekelerini oda sıcaklığında üç saat kuruttuktan sonra bir pipet kullanarak filtre kartlarında her dairenin ortasına 50 mikrolitre çivili tam kan koyun, insan EDTA tam kanında takrolimus kalibrasyon standartlarını bir 2.5, 5, 10, 25 ve 50 nanogram mililitre başına hazırlayın.

Dahili standart D iki 13 C takrolimus içermeyen, protein çökeltme çözeltisi ile kalibrasyon standartları gibi ekstraksiyon için boş bir numune hazırlayın. Daha sonra, insan EDTA tam kanında mililitre başına 0, 2, 4, 20 ve 40 nanogram konsantrasyonlarda kalite kontrol örnekleri hazırlayın. Boş bir numune de hazırlayın Kurumuş kan lekelerini topladıktan sonra, kabul edilebilir numune kalitesi ve hacmini sağlamak için her birini görsel olarak inceleyin.

Ardından, filtre kartındaki kan lekesinin merkezini altı milimetrelik bir delgeç ile delin. Diskleri konik tabanlı 1,5 mililitrelik polipropilen tüplere yerleştirin ve kapakları kapatın. Her tüpe 20 ila 30 mermi ekleyin.

Bunu takiben, her tüpe 500 mikrolitre protein çökeltme çözeltisi ekleyin. Diskleri bir mermi karıştırıcıda maksimum hızda bir dakika boyunca homojenize edin. Bittiğinde, numuneleri oda sıcaklığında çok tüplü bir girdap üzerinde maksimum hızda 10 dakika çalkalayın.

Daha sonra numuneleri 16.000 GS ve dört santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, SNAT'ı 300 mikrolitrelik bir ek ile donatılmış cam HPLC şişelerine aktarın. Bu noktada, ekstrakte edilen numunenin 100 mikrolitrelik süpernatını, dakikada beş mililitrelik bir akışta su ve asit nitril içinde yedi ila üç oranında% 0.1 formik asit ile C sekiz kartuşlu ekstraksiyon sütunu yıkamasına yükleyin.

Bundan sonra bir dakika boyunca anahtarlama valfini etkinleştirin ve bu da analitlerin ön kaldan analitik kolona geri yıkanmasına neden olur. Ardından kolon termostatını 65 santigrat dereceye ayarlayın. Burada gösterilen akış hızlarını ve gradyanı kullanarak analitleri analitik kolondan çıkarın.

Analitik kolonu, turbo elektrosprey iyonizasyon kaynağı aracılığıyla bir tandem kütle spektrometresine bağlayın. Kütle spektrometresinin temel parametrelerini aşağıdaki tabloya göre ayarlayın. Ardından, çoklu reaksiyon modunda pozitif iyonları tespit edin.

Kurumuş kan lekelerindeki takrolimusu ölçmek için, boş bir numunenin kütle spektrometresi yazılımı temsili iyon kromatogramlarını kullanarak kalibrasyon eğrisi ile karşılaştırın. Kantifikasyonun alt sınırında çivilenmiş bir numune ve bir hasta numunesi burada gösterilmektedir. Burada tipik bir kalibrasyon eğrisi gösterilmektedir.

Ortalama korelasyon katsayısı 0.9994'tür. Doğruluk ve hassasiyet sonuçları burada ayrıntılı olarak gösterilmektedir. Önemli bir iyon baskılanması veya iyon artışı belirtisi gözlenmedi ve tepe noktalarının aşılmasına neden olan ilgili bir taşınma gözlenmedi.

Kantitasyonun alt sınırındaki sinyalin %15'i tespit edildi. Seyreltme bütünlüğü, en yüksek kalibratörün üzerindeki konsantrasyonlarda hazırlanan ve hedef konsantrasyonlara ulaşmak için ekstraksiyondan sonra protein çökeltme çözeltisi içinde seyreltilen numunelerin analiz edilmesiyle araştırıldı. Test edilen tüm seyreltmeler kabul kriterlerini karşıladı.

Oda sıcaklığında bir haftalık depolamadan sonra, dört santigrat derecede bir haftalık depolamadan sonra ve eksi 20 santigrat derecede bir aylık depolamadan sonra herhangi bir kayıp görülmedi. Ek olarak, üç donma ve çözülme döngüsünden sonra eksi 80 santigrat derecede bir aylık depolamadan sonra ve otomatik örnekleyicide dört santigrat derecede 72 saatlik ekstrakte edilmiş numuneden sonra herhangi bir kayıp gözlenmedi. Mastering yapıldıktan sonra 20 numune bir saatten daha kısa sürede çıkarılabilir.

Bu prosedürü denerken, güvenilir miktar tayininin anahtarının kurumuş kan lekesinin kalitesi olduğunu ve diskin filtre kağıdının tamamen doymuş bir bölgesinden delindiğini hatırlamak önemlidir. Bu videoda gösterilen teknikler ve tahlil, kurumuş kan lekelerinde diğer immünosupresanları ve ilaçları ölçmek için bir platform teknolojisi sağlar.