Avaliando Encefalopatia Espongiforme Transmissível Espécies Barreiras com uma In Vitro Prion Conversão Protein Assay

O objetivo geral deste procedimento é avaliar a barreira de espécies de esponja transmissível para encefalopatias, conhecida como TSC para uma determinada espécie, sem a necessidade de desafiar animais vivos. Isso é feito preparando primeiro dois substratos de ensaio de conversão para uso em um ensaio in vitro. O segundo passo é incubar esses substratos com os agentes TSE que você deseja testar em seguida.

Após a digestão com Protase K, as amostras são submetidas à página SDS e imunosangue. A etapa final é medir a quantidade de proteína PreOn resistente à proteinase K em cada substrato usando citometria D e comparar essas quantidades pelo cálculo de uma taxa de eficiência de conversão ou CER. Em última análise, a RCE fornece uma medida da barreira entre as espécies testadas para as EET às espécies hospedeiras a partir das quais o substrato foi preparado.

As vantagens deste ensaio incluem seu baixo custo, curto período experimental e substituição de animais vivos por amostras de tecido. Embora este método seja adequado para fornecer informações sobre as barreiras de espécies de doenças priônicas da vida selvagem, ele pode ser aplicado a qualquer outra espécie de interesse. Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades com a preparação do substrato, controle de qualidade e padronização.

Depois de obter tecido cerebral saudável não infectado da espécie de interesse, prepare um homogeneizado de 10% de peso por volume em tampão de lise usando moinho de esferas de dúvidas ou almofariz e pilão. Homogeneização. Em seguida, refine ainda mais os homogeneizados, submetendo-os a uma seringa e homogeneização de agulha usando agulhas de calibre crescente até que o substrato possa ser aspirado e expelido com facilidade através de uma agulha de seringa de calibre 27. Em seguida, divida o homogeneizado cerebral em dois volumes iguais em tubos cônicos de plástico marcados separados e adicione três cloridrato de guiné molar em um XPBS em pH 3,5 ou 7,4 a cada tubo em uma proporção de volume de um para um para o homogeneizado cerebral.

Agora, verifique os valores de pH das soluções de substrato e use ácido clorídrico concentrado ou hidróxido de sódio conforme necessário para garantir que o pH de cada substrato permaneça dentro de mais ou menos 0,05 do pH alvo. Gire as soluções em um misturador de ponta a ponta em temperatura ambiente por cinco horas. Em seguida, precipite a proteína adicionando quatro volumes de metanol às soluções de substrato em cada vórtice cônico para misturar bem e incubar a 20 graus Celsius negativos por 16 a 18 horas.

Após a incubação, sedimentar as amostras por centrifugação a 13.000 G por 30 minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, decantar e rejeitar cuidadosamente os sobrenadantes S e deixar o metanol evaporar das paletes. Use aplicadores com ponta de algodão para ajudar a absorver o metanol agarrado ao interior do tubo.

Não deixe os pellets secarem demais. Prossiga para a próxima etapa, quando o metanol não estiver mais visível, use uma quantidade de tampão de conversão igual à quantidade de material de partida do homogeneizado cerebral para ressuspender os grânulos de proteína. Após resus, sonicar brevemente as soluções de substrato por 10 segundos.

Em um chifre de xícara, sonice a aproximadamente 30% da potência máxima. Em seguida, alíquota das soluções em volumes de 0,5 a um mililitro em tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro rotulados, pois uma proteína príon celular em ambos os substratos deve ser sensível à proteinase K. Trate 10 a 25 microlitros de cada substrato com proteinase K a uma concentração final de 100 microgramas por mililitro e digerir amostras a 1000 RPM a 37 graus Celsius por uma hora no agitador térmico, carregue os substratos digeridos pela proteinase K, juntamente com 10 a 25 microlitros de cada substrato não digerido.

Em uma página SDS, gel e imunobloqueio com um anticorpo específico da proteína príon para avaliar a proteína príon do hospedeiro, a resistência à proteinase K e os níveis de proteína não digerida. Esta imagem mostra os resultados do immunoblot. As duas primeiras pistas contêm os substratos não digeridos e as duas pistas à direita contêm o substrato digerido pela proteinase K.

Se os níveis de proteína nos substratos de pH 7,4 e 3,5 estiverem dentro de aproximadamente 10% um do outro e não forem resistentes à proteinase K, os pares de substratos são apropriados para uso em estudos de CER armazenam outras alíquotas a 80 graus Celsius negativos até que estejam prontos para realizar o ensaio CER. Os agentes de EET devem ser manuseados com precauções de biossegurança adequadas e de acordo com as directrizes institucionais. Após a obtenção de tecido cerebral infectado com EET da espécie de interesse, preparar um homogeneizado de 10% de peso a volume em um XPBS a pH 7,4 usando o método de homogeneização usado anteriormente para a preparação dos pares de substratos.

Aqua os homogeneizados resultantes em volumes de 100 a 300 microlitros em tubos de microcentrífuga de 0,5 mililitro e armazenados a 80 graus Celsius negativos até que estejam prontos para realizar o ensaio CER. Para começar, descongele lentamente quantidades iguais do substrato CER não infectado de pH 3,5 e 7,4, emparelhe e soluções de sementes infectadas com TSE, colocando-as em cima de um leito de gelo por aproximadamente uma hora. Após o descongelamento, mantenha as soluções no gelo primeiro homogeneizar novamente aspirando e expelindo cada solução de substrato através de uma agulha de seringa de calibre 27

Em seguida, sonicar brevemente cada solução infectada com EET durante 10 segundos a aproximadamente 30% da potência máxima. Em seguida, prepare as reações de conversão em tubos de PCR de parede fina de baixa ligação rotulados pipetando 95 microlitros de substrato CER. Preparado em pH 7,4 em duplicata para dois dos tubos e 95 microlitros de substrato CER preparado em pH 3,5 em duplicata em mais dois tubos.

Em seguida, adicione cinco microlitros de solução de semente infectada com 10% TSE a um tubo de cada substrato de pH 7,4 e 3,5. Paralelamente, adicione cinco microlitros de tampão de conversão ao outro tubo de cada substrato de pH 7,4 e 3,5 para controlar a conversão não específica não moldada. Além disso, prepare um controle para a proteína príon resistente à proteinase K de entrada.

Para cada agente de EET a ser testado, adicione cinco microlitros de solução de semente infectada com 10% de TSE a 95 microlitros de tampão de conversão como controle. Um breve vórtice de cada amostra em seu tubo de PCR fechado, dedo do pé e substrato. Bem, siga com um pulso momentâneo em uma minicentrífuga de bancada de baixa velocidade para remover qualquer volume da mistura de reação presa na tampa do tubo de PCR.

Carregue os tubos em um agitador térmico de bancada equipado para aceitar tubos de PCR e agite as amostras a 1000 RPM a 37 graus Celsius por 24 horas no dia seguinte, adicione a célula sarco a uma concentração final de 2% de peso por volume e a proteinase K a uma concentração final de 100 microgramas por mililitro de amostras de digestão a 1000 RPM a 37 graus Celsius por uma hora no agitador térmico. Adicione amostras de calor de tampão de amostra de página SDS a 95 graus Celsius por 10 minutos e resolva a proteína PreOn resistente à pronase K restante em cada amostra por página SDS, seguida de immuno blotting como antes. Por fim, calcule a taxa de eficiência de conversão como uma medida da barreira das espécies.

De acordo com as instruções no camundongo do protocolo escrito, o substrato do ensaio CER preparado em pH 7,4 ou 3,5 foi incubado com camundongo RML adaptado raspado, ovelhas domésticas, raspagem clássica, veado de cauda branca doença crônica debilitante ou 2 cepas de 63 K de hamster adaptado raspado. No ensaio CER, as amostras de controle marcadas como nenhuma continha uma quantidade igual de agente infeccioso e nenhuma amostra de substrato de camundongo foi analisada quanto à presença de proteína príon resistente à proteinase K por immunoblot com anticorpo monoclonal. SAF 83.

Os valores tric brutos para cada amostra são exibidos abaixo de cada proteinase resultante da pista. Os níveis de proteína príon resistente a K foram variáveis entre os substratos de camundongos, desnaturados em pH 7,4 e assentados com os vários agentes de EET. Embora a proteína príon resistente à pronase K tenha sido encontrada em todos os substratos, desnaturada a pH 3,5 e assentada com um agente TSE, este gráfico de barras mostra as proporções médias mais ou menos desvio padrão entre pH 7,4 e 3,5 substratos de camundongo para cada agente infeccioso com base em pelo menos três ensaios independentes.

Letras minúsculas referem-se a subconjuntos estatisticamente homogêneos, conforme determinado por um valor de p inferior a 0,05 usando análise de variância. Com o método de diferenças mínimas de significância de Tookie Kramer Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em menos de 48 horas se executada corretamente. O ensaio CER pode ser utilizado como uma avaliação inicial da existência de uma barreira de espécies de EET que possa justificar ou evitar estudos adicionais em animais vivos.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar substratos, configurar reações de conversão e calcular taxas de eficiência de conversão para avaliar as barreiras das espécies.