Name: Immunhistochemie und Multiple Markierung mit Antikörper aus dem gleichen Host Arten, die Adult Neurogenese Studieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Lernen Sie eine sequenzielle Immunfluoreszenzmethode zur Quantifizierung adulte Hippocampus-Neurogenese in Gewebeschnitten. Dieses Protokoll ermöglicht Mehrfachmarkierungen mit Antikörpern gleicher Wirtsarten.

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Die Autoren danken S. Tausch für die hervorragende technische Unterstützung. Die Arbeit wurde gefördert durch das BMBF (Bernstein Focus 01GQ0923) und die DFG (FOR1738).

HINWEIS: Alle Verfahren, die lebende Tiere wurden in Übereinstimmung mit der EG-Richtlinie 86/609 / EWG des Rates Leitlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren und von der Ethikkommission (Thüringer Landesamt für Lebensmittelsicherheit und Verbraucherschutz) zugelassen wurde. 1. intraperitoneale Injektion von Thymidinanaloga <ol><li> Wiegen Tiere am Tag vor der Injektion. Berechnen Sie die Menge an Thymidin-Analogon für alle am nächsten Tag sowie individuelle Gewicht angepassten Injektionsvolumina einer 10 mg / ml Stammlösung geplant Injektionen erforderlich. </li><li> Bereiten Sie 10 mg / ml Thymidin-Stammlösung. (VORSICHT! Thymidin-Analoga sind giftig. Folgen Sie den spezifischen Sicherheitsdatenblätter (MSDS) von den Lieferanten zur Verfügung gestellt, also tragen Laborkittel und Schutzhandschuhe, mit einem Laborabzug). <ol><li> Nehmen Thymidin-Analogon aus dem Gefrierschrank und bringen es auf RT, ca. 21 ° C. Wiegen Sie 10 mg und fügensteriler Kochsalzlösung (für BrdU und CldU) oder 0,04 N NaOH (in steriler Kochsalzlösung, für IDU), Wirbel. Platz für mindestens 10 bis 15 Minuten lang in einem 50 ° C Wasserbad und Wirbel alle 2 - 3 Minuten, um das Pulver aufzulösen. HINWEIS: Lösungen für bis zu 24 Stunden, wenn sie bei Raumtemperatur und für mehrere Wochen bei -20 ° C gelagert. Schützen Lösungen von Licht (Abdeckung mit Aluminiumfolie). Kontrollieren Sie immer die Niederschläge und wieder auflösen, wenn nötig. </li></ol></li><li> Restrain die Maus durch das Genick und intraperitoneale Injektion eines geeigneten, dem Gewicht angepassten Volumen der Stammlösung (bei Raumtemperatur) mit einer feinen Dosierung Spritze mit einer 30 G-Nadel. HINWEIS: Bei CldU und IdU müssen nacheinander im gleichen Tier verabreicht werden, zu prüfen, um äquimolare Konzentrationen injiziert (zB 42,5 mg / kg CldU und 57,5 mg / kg IdU, die 50 mg / kg BrdU entsprechen). Deshalb passen Sie die Injektionsvolumina der 10 mg / ml-Stammlösungen. </li></ol> 2. Gewebepräparation <ol><li> PrepaWieder 4% Formaldehyd in 0,1 M Phosphatpuffer pH 7,4 am Tag vor Perfusion. Lagerung bei 4 ° C. </li><li> Transkardial perfuse die tief narkotisierten Mäusen (3,5% Isofluran) über der linken Herzkammer mit 10 ml eiskaltem PBS, dann mit 40 ml eiskaltem Formaldehyd (Durchflussrate von 5 ml / min). Präparieren des Gehirns und post-fix im gleichen Fixativ für 24 h bei 4 ° C. </li><li> Übertragen Sie die Gehirne nacheinander in 10% (24 Stunden bei 4 ° C) und 30% Saccharose (bis das Gehirn sinkt, ca. 48 h). Zum Einfrieren langsam tauchen die kryogeschützt Gehirn in -25 ° C Isopentan bis keine Luftblasen entstehen aus dem Gewebe. Bei -80 ° C. </li><li> Geschnitten Koronalschnitte von 40 um Dicke auf einem Gefriermikrotom (Blocktemperatur bei -25 bis -16 ° C). Sequenziell Übertragungsabschnitten in Frostschutzlösung, die Vertiefungen einer 24-Well-Zellkulturplatte (siehe Abbildung 1). Lagerung bei -20 ° C. </li></ol><img alt = &quot;1&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 52.551 / 52551fig1.jpg&quot; /&gt; Abbildung 1. Schematische Darstellung der Übertragung von Mikrotom Scheiben in eine 24-Well-Platte. Bei A1 starten und legen nachfolgende Scheiben in Reihe A nach A6 gehen in die nächste Zeile B und so weiter. Bei Erreichen D6, gehen Sie zurück zu A1 und fortfahren. Diese Anordnung von Scheiben ermöglicht die Quantifizierung von jedem n-ten Abschnitt eines gesamten Gehirns. Zur Quantifizierung von neugeborenen Zellen nehmen jeden 6. Hirnschnitt (entsprechend dem Inhalt einer Spalte), Immunfluoreszenz Phänotypisierung nehmen jeden 12-ten Abschnitt (entspricht dem Gehalt von 2 alternierende Reihen von einer Spalte). 3. Immunfärbung HINWEIS: Abschnitte verarbeitet frei schwebenden, in der Regel in 6-Well-Platten mit einer Trägerplatte ausgestattet und Mesh-Einsätzen. Ausnahmsweise Blockieren, Antikörperinkubationen und ABC-Reaktion sind in 12- oder 24-Well-Platten durchgeführt, ohne Mesh-Einsätze (0,5 bis 1 ml pro well reicht, abhängig von der Anzahl der Schichten, die gefärbt werden müssen). Während dieser Schritte Übertragungsabschnitte mit Hilfe einer feinen Bürste (Spülen mit jeder neuen Lösung). Alle Inkubationen werden unter ständigem Rühren (max 150 rpm) durchgeführt. <ol><li> Immunhistochemie (ABC-Methode) <ol><li> Übertragen Sie Abschnitte von Frostschutzmittel in TBS und gründlich (einmal O / N bei 4 ° C, 5-mal bei RT für 10 Minuten jede) zu Frostschutzmittel vollständig zu entfernen. </li><li> Inkubieren für 30 min in 1,5% H 2 O 2 in TBS-T, um endogene Peroxidase-Aktivität zu quenchen. Achten Sie auf die Blasenbildung und wieder tauchen Abschnitte, wenn nötig. Spülen Sie 3 mal in TBS 15 min je. </li><li> Optional: Inzwischen vorzuwärmen Heizschrank und 2 N HCl auf 37 ° C. Abschnitte Inkubation 30 min bei 37 ° C in 2 N HCl, um DNA zu denaturieren. Sanft getrennte Abschnitte mit Hilfe eines Pinsels. </li><li> Optional: Neutralisieren Sektionen für 10 min in 0,1 M Boratpuffer pH8,5, RT. Während der Übertragung, kurz Tupfer die Mesh-Einsätze, die die Abschnitte auf einem Papiertuch, um HCl leavings entfernen. Spülen Sie 2 mal in TBS 15 min je. </li><li> Inkubieren in TBSplus, um das Gewebe durchlässig und unspezifische Antikörperbindungsstellen, 1 h bei RT zu blockieren. </li><li> Inkubieren in primären Antikörper in TBSplus, O / N bei 4 ° C verdünnt. Spülen Sie 3 mal in TBS 15 min je. </li><li> Inkubiere in biotinylierten sekundären Antikörper in TBSplus, 3 h bei RT verdünnt. Spülen Sie 3 mal in TBS 15 min je. In der Zwischenzeit ... </li><li> Bereiten ABC-Komplex gemäß dem Protokoll des Herstellers (1% A + 1% B in TBS-T). Man lässt 30 min bei RT stehengelassen, bevor Gebrauch. Abschnitte AB Reagenz Inkubation für 1 h bei RT. Spülen Sie 3 mal in TBS 15 min je. </li><li> Bereiten Sie 50 ml 0,5 mg / ml DAB in TBS-T pro 6- oder 12-Well-Platte, aufgeteilt in zwei Hälften und Pipette 4 ml oder 2 ml pro Vertiefung auf. Übertragungsabschnitten in DAB-Lösung (VORSICHT! DAB ist giftig. Folgen Sie der spezific Sicherheitsdatenblatt des Lieferanten, dh tragen Laborkittel und Schutzhandschuhe, mit einem Laborabzug). </li><li> 0,5 ml 1% H 2 O 2 zu den verbleibenden 25 ml DAB-Lösung, zu mischen und Pipetten äquivalente Volumina wie oben in jede Vertiefung Peroxidase-Reaktion gestartet werden. Inkubieren für 12 min. Spülen Sie 3 mal in TBS 15 min je. </li><li> Berg Abschnitte Folien in Gelatine, an der Luft trocknen O / N. Deckglas mit permanentes Fixiermittel. </li><li> Optional: bevor Sie das Deckglas Gegenfärbung (siehe Abschnitt 3.5). HINWEIS: Wenn das Signal-zu-Rausch-Verhältnis niedrig ist, da der hohe Hinter Wiederholen H 2 O 2 -Behandlung nach der Inkubation mit AB-Reagenz (Schritt 3.1.8). </li></ol></li><li> Multiple-Immunfluoreszenz <ol><li> Einzelne oder gleichzeitig mehrere Immunfluoreszenz <ol><li> Übertragen Sie Abschnitte von Frostschutzmittel in TBS und gründlich (einmal O / N bei 4 ° C, 5-mal bei RT für 10 min jeweils) vollständig zu entfernen eintifreeze. </li><li> Optional: wie Sie die Schritte 3.1.3 - 3.1.4. </li><li> Inkubieren in TBSplus, um das Gewebe durchlässig und blockieren unspezifische Antikörperbindungsstellen, 1 h bei RT. </li><li> Inkubieren in primären Antikörper-Cocktail (zB Ratten α-BrdU, Meerschweinchen α-DCX, Ziegen α-GFP) in TBSplus, O / N bei 4 ° C verdünnt. Spülen Sie 3 mal in TBS 15 min je. </li><li> Inkubieren in Cocktail aus einem Fluorochrom konjugierte Sekundärantikörper (zB Rhodamin Red α-rat, Alexa-647 α-Meerschweinchen, Alexa-488 α-Ziege, alle in Esel abgeleitet) in TBSplus verdünnt, 3 Stunden bei Raumtemperatur oder O / N bei 4 ° C. Ab sofort schützen Schnitte von Licht. Spülen Sie 3 mal in TBS 15 min je. </li><li> Berg Abschnitte Folien in Gelatine, an der Luft trocknen O / N. Deckglas mit wässrigem Eindeckmedium. </li></ol></li><li> Sequential mehrere Immunfluoreszenz mit primären Antikörpern aus derselben Wirtsspezies <ol><li> Da die Schritte 3.2.1.1 - 3.2.1.3. </li><li> Inkubieren in fiersten primären Antikörper (zB Kaninchen α-Antigen A), O / N bei 4 ° C. 3 mal in TBS und einmal Spülen in TBS-T für jeweils 10 min. </li><li> Inkubieren im ersten Fluorochrom-konjugierten Sekundärantikörper (zB Rhodamin Red-Konj. Esel α-Kaninchen), 3 Stunden RT. Ab sofort schützen Schnitte von Licht. 3 mal in TBS und einmal Spülen in TBS-T für jeweils 10 min. </li><li> Inkubieren in 10% Normalserum von demselben Host wie die primären Antikörper (zB Kaninchenserum) für 3 h RT offen Paratope am ersten sekundären Antikörpers sättigen. 3 mal in TBS und einmal Spülen in TBS-T für jeweils 10 min. </li><li> Inkubiere in TBSplus mit 50 ug / ml unkonjugierter einwertige Fab-Fragmente gegenüber dem Gastgeber der primären Antikörper gerichtet (zB α-Kaninchen-IgG (H + L)) an Epitope, die von dem zweiten sekundären Antikörper, O / N erfasst werden kann abzudecken 4 ° C. </li><li> Mindestens 3 mal in TBS und einmal Spülen in TBS-T für jeweils 10 min. Während der Übertragung, kurz swab die Mesh-Einsätze, die die Abschnitte auf einem Papiertuch, um alle Fab leavings entfernen. </li><li> Inkubieren im zweiten primären Antikörper (zB Kaninchen α-Antigen B), O / N bei 4 ° C. 3 mal in TBS und einmal Spülen in TBS-T für jeweils 10 min. </li><li> Inkubieren im zweiten Fluorochrom-konjugierten Sekundärantikörper (zB Alexa-488-Konj. Esel α-Kaninchen), 3 Stunden RT. Spülen Sie 3 mal in TBS 15 min jeweils, montieren und Deckglas oben. HINWEIS: Um die Antigene mit Antikörpern beschriften aus verschiedenen Wirtsarten fügen Sie sie in Schritt 3.2.2.2 und den entsprechenden Sekundärantikörper zu Schritt 3.2.2.3. </li></ol></li><li> Eine der sekundären Antikörper aus derselben Spezies wie eine der primären Antikörper Hinweis: Dieses Protokoll ist zusammen mit GFAP, Nestin-GFP und DCX geeignet für Vierfachfärbung gegen BrdU oder Ki67. <ol><li> Befolgen Sie streng Protokoll Schritte 3.2.1.1 - 3.2.1.5. Bis zu diesem Zeitpunkt ausschließlich Eselserum in TBSplus. </li><li> Inkubiere in TBSplus enthaltend 3% Ziegenserum, 1 h bei RT. Dies umfasst offene Paratope auf der α-Ziege sekundären Antikörper. 3 mal in TBS und einmal Spülen in TBS-T für jeweils 10 min. </li><li> Inkubieren in AMCA-Konj. Ziegen α-Kaninchen in TBSplus, 3 Stunden RT oder O / N 4 ° C verdünnt. Dreimal in TBS Spülen für 15 Minuten jeweils, montieren und Deckglas oben. </li></ol></li><li> CldU, IdU Co-Färbung <ol><li> Spülen, denaturieren und zu neutralisieren Abschnitte, wie in Abschnitt 3.2.1 beschrieben (Schritte 3.2.1.1 - 3.2.1.2). </li><li> Inkubieren mit 20 ug / ml unkonjugierter Fab Fragmente α-Maus-IgG (H + L) in TBSplus, 1 h bei RT. Spülen 4 mal in TBS und einmal in TBS-T für jeweils 10 min. </li><li> Inkubieren in primären Antikörper-Cocktails Ratte α-BrdU (1: 400; gereinigt IgG2) und Maus-α-BrdU (1: 350) in TBSplus, O / N bei 4 ° C verdünnt. 3 mal in TBS und einmal Spülen in TBS-T für jeweils 10 min. </li><li> Inkubation in sekundärem Antikörper-Cocktail enthält biotinylierten Esel α-Ratte (1: 500) und FITC-conj. Esel α-Maus-Fab-Fragmente (1: 100). 3 mal in TBS und einmal Spülen in TBS-T für jeweils 10 min. </li><li> Inkubieren in Rhodamin Red-Konj. Streptavidin, 2 h bei RT. Spülen Sie 3 mal in TBS 15 min jeweils, montieren und Deckglas oben. </li></ol></li><li> Die Amplifikation von Fluoreszenzsignal in Nestin-GFP-Mäuse <ol><li> Hinzufügen Ziege α-GFP an den primären Antikörper-Cocktail. </li><li> Hinzufügen eines Fluorochrom konjugierten sekundären Antikörpers mit spektralen Eigenschaften ähnlich GFP (wie Alexa 488 conj. Esel α-Ziege) an den sekundären Antikörper-Cocktail. </li></ol></li></ol></li><li> Epitopdemaskierung <ol><li> Führen Sie Epitopdemaskierung nach dem Ausspülen Frostschutzmittel. Vorheizen Dämpfer mit 6- oder 12-Well-Platten mit 0,1 M Citratpuffer pH 6,0 bis 95 bis 99 ° C (etwa 25 min). </li><li> Übertragen Sie die Abschnitte in die heiße Citratpuffer und Dampf für 30 Minuten (die Platten abdecken mit Aluminiumfolie als Kunststoff lIDs sind nicht hitzebeständig). </li><li> Unmittelbar danach die Platten in einem Eisbad abkühlen. Dies hilft, um Gewebemorphologie, die von besonderer Bedeutung ist bei der Arbeit mit Hirnschnitten der postnatalen Tieren zu schützen. </li><li> Spülen Sie 3 mal in TBS für jeweils 10 min zu spülen und zu neutralisieren, das Citrat und weiterhin Färbung. </li></ol></li><li> Maus-Antikörper auf Mausgewebe <ol><li> Mit 20 &amp; mgr; g / ml einwertige Fab-Fragmente α-Maus-IgG (H + L; gleichen Wirtsart als sekundärer Antikörper) zu der ersten Sperrstufe (zB Schritt 3.1.5 oder 3.2.1.3). </li><li> Spülen Sie 4-mal in TBS und einmal in TBS-T für 10 Minuten jeweils, und fahren Sie mit entsprechenden Protokoll. </li></ol></li><li> Kresylviolett Gegenfärbung <ol><li> Vorheizen Kresylviolett Lösung auf 60 ° C (im Glas). Die Objektträger in der heißen Lösung für 3 min. </li><li> Spülen Sie in aq. dest. und dehydratisieren 2 Mal für jeweils 1 min in 70%, 96% und 100% Isopropanol ist. </li&gt; <li> Klar für 5-6 min in Xylol oder Xylol-Ersatzstoff und Deckglas mit einem kompatiblen permanentes Fixiermittel. </li></ol></li></ol> 4. Datenanalyse <ol><li> Graf Peroxidase gefärbt neugeborenen Zellen in jedem 6-ten Abschnitt entlang der gesamten rostrokaudalen Umfang des Gyrus dentatus. Verwenden Sie ein Lichtmikroskop bei 400-facher Vergrößerung. </li><li> Multiplizieren die resultierende Zellzahlen mit dem Schnittpunkt-Intervall, um eine Schätzung der Gesamtzahl der Neugeborenen-Zellen zu erhalten. </li><li> Bild der Fluoreszenz mit einem konfokalen Lasermikroskops mit geeigneten Laser und Filtersystemen ausgestattet beschriftet Abschnitte. Nehmen Bildstapeln an zufälligen Positionen entlang der gesamten Ausdehnung des Gyrus dentatus bei 400-facher Vergrößerung und mindestens 50 zufällig ausgewählten interessierenden Zellen pro Hemisphäre für die Co-Markierung mit anderen Markern analysiert. </li><li> Multiplizieren die resultierende Prozentsatz der co-markierten Zellen (% / 100) mit der Gesamtzahl der neugeborenen Zellen zu berechnen absoluteNummern bestimmter neugeborenen Zellpopulationen. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Quantifizierung und Identifizierung von Subpopulationen von neugeborenen Zellen ist ein zentrales Thema in der adulten Neurogenese Forschung. Die Kombination von Proliferationsmarker und Antikörper gegen Proteine ​​in bestimmten Phasen der adulten Neurogenese ausgedrückt ermöglicht immunhistochemischen Nachweis dieser Subpopulationen. Einige der Antikörper oder Antikörperkombinationen erfordern spezifische Färbung Bedingungen. Kennzeichnung von sich teilenden Zellen mit synthetischen Thymidi...

Zwei Hirnregionen konstitutiv erzeugen neue Nervenzellen während des gesamten Lebens, das Subventrikularzone der Seitenventrikel und der Subgranularzone (SGZ) des Gyrus dentatus des Hippocampus (DG). Die neugeborenen Neuronen stammen aus neuralen Vorläuferzellen und durchlaufen verschiedene Stadien der morphologischen und physiologischen Entwicklung vor Erreichen der Geschlechtsreife 1,2. Aus einem sich langsam teil radialen Gliazellen artigen Stammzellen (Typ 1) aufeinanderfolgenden Stufen der transit amplifying Zwischenvorläuferzellen entstehen. Je mehr undifferenzierte Untertypen (Typ 2a und Typ 2b) eine unregelmäßige Form mit kurzen, tangentialen Prozesse. Sie erzeugen Neuroblasten (Typ 3), die nach und nach in den Zellzyklus verlassen, um unreife Neuronen werden (mit Dendriten erweitert in Richtung der molekularen Schicht) und schließlich in den Hippocampus-Netzwerk als reife Körnerzellen zu integrieren. Aufgrund ihrer besonderen physiologischen Eigenschaften diese Zellen stellen die Schaltung mit verbesserter Plastizität 3 suggesting eine einzigartige Rolle bei der Funktion des Hippocampus. Eigentlich Studien der letzten zehn Jahre generiert erhebliche Beweise dafür, dass die adulte Neurogenese trägt zur räumlichen Gedächtnisses, Muster Trennung und emotionales Verhalten 4,5. Adulte Neurogenese kann durch verschiedene Ansätze untersucht werden. Thymidinanaloga integrieren in die DNA während der S-Phase des Zellzyklus und ermöglichen Geburt aus, Quantifizierung und Schicksal Analyse der neugeborenen Zellen 6-8. Sequentielle Anwendung unterschiedlicher Thymidin-Analoga (zB CldU, EdU oder IdU) kann zur Zellerneuerung oder Zellpopulationen zu verschiedenen Zeitpunkten während des Verlaufs des Experiments 9 geboren untersuchen. Eine Alternative, endogenen Marker für Zellproliferation Ki67. Es ist in sich teilenden Zellen in allen Phasen des Zellzyklus (G1, S, G2, M), mit Ausnahme der Ruhephase (G0) und dem Beginn des G1 10,11 ausgedrückt. Um den Phänotyp Neugeborenen Zellpopulationen in der Erwachsenen dentat analysierene Gyrus mehrere stufenspezifische molekulare Marker wie GFAP, Nestin, DCX und NeuN 1,6 verwendet werden. GFAP ist ein Marker für reife Astrozyten wird aber auch in radialer Gliazellen-ähnlichen Zellen in der adulten Vorderhirn exprimiert. Nestin ist ein Zwischenfaden spezifisch für radiale Glia-ähnlichen Zellen und frühen Zwischen Progenitorzellen. DCX ist ein Mikrotubuli-assoziierten Protein in Zwischenvorläuferzellen, Neuroblasten und unreife Neuronen exprimiert. Auf der Grundlage der (Mit-) Expression dieser drei Marker und die morphologischen Merkmale der markierten Zellen vier verschiedene Vorläuferzelltypen zu unterscheiden: Typ 1 (GFAP +, Nestin +, DCX -), Typ 2a (GFAP - Nestin + , DCX -) Typ 2b (GFAP - Nestin +, DCX +) und Typ 3 (GFAP - Nestin -, DCX +) ein. Co-Kennzeichnung von DCX mit NeuN, die in postmitotischen Neuronen exprimiert wird, ermöglicht die Differenzierung von immature (DCX +, NeuN +) und reifen (DCX -, NeuN +) Körnerzellen. Die oben genannten Markierungen werden häufig für Immunofluoreszenz co-Kennzeichnung und anschließende konfokale Mikroskopie verwendet, um die Anzahl und die Identität von neugeborenem Zellen zu analysieren. Dies erfordert typischerweise Antikörper aus verschiedenen Wirtsspezies zu unerwünschten Antikörper Kreuzreaktivität verhindern. Allerdings ist die Mehrzahl der primären Antikörper für die Neurogenese Forschung angehoben entweder in Kaninchen oder Mäusen (zB Maus-α-BrdU, Maus α-NeuN, Kaninchen α-Ki67, Kaninchen α-GFAP). Dies führt zu starken Einschränkungen hinsichtlich der Anzahl und Kombination von Antigenen, die in einer einzigen Scheibe ausgewertet werden konnte. Dies wiederum nicht steigt nur der Färbung Aufwand, da mehrere Färbungen müssen durchgeführt werden, sondern könnte auch die Zuverlässigkeit der Ergebnisse zu beeinträchtigen. Darüber hinaus sind einige Antigene anfällig für Formalinfixierung induzierte Epitop Maskierung (zB Ki67Nestin). Wir beschreiben hier Änderungen von den klassischen Ein- und Mehr Immunomarkierung Protokolle (zB Epitopdemaskierung, mehrere aufeinander folgende Immunfärbung, die Verwendung von Nestin-GFP transgenen Mäusen, 12), die viele dieser Probleme zu überwinden. Insbesondere erlaubt die sequenzielle Mehrfachimmunfärbungsprotokolls gegen bis zu vier unterschiedlichen Antigene auch wenn ein Teil der Antikörper wird aus dem gleichen Wirt stammen. Dies ermöglicht den gleichzeitigen Nachweis von Typ 1, Typ 2a, 2b Typ und Typ 3-Vorläuferzellen, sowie ihre proliferative Aktivität innerhalb einer einzelnen Seite.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Thymidin-Analogon Verabreichung</td></tr><tr><td>5-Brom-2&prim;-Desoxyuridin, BrdU</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B9285</td><td>toxisch (mutagen, teratogen)</td></tr><tr><td>5-Chlor-2&prim;-Desoxyuridin, CldU</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6891</td><td>toxisch (mutagen, teratogen)</td></tr><tr><td>5-Chlor-2&prim;-Desoxyuridin, CldU</td><td>MP Biomedicals</td><td>2105478</td><td>toxisch (mutagen, teratogen)</td></tr><tr><td>5-Iod-2&prime;-Desoxyuridin, IdU</td><td>MP Biomedicals</td><td>2100357</td><td>toxisch (mutagen, teratogen)</td></tr><tr><td colspan="4">Gewebepräparat</em</td></tr><tr><td>>Isofluran-Actavis</td><td>Piramal Healthcare</td><td>700211</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd Pulver (PFA)</td><td>Riedel-De H&auml; en</td><td>16005</td> giftige<td>, brennbare</td></tr><tr><td>Perfusionspumpe PD5206</td><td>Heidolph Instruments</td><td>523-52060-00</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex Tygon Laborschlauch, &Oslash; 0,8 mm</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>06409-13</td><td></td></tr><tr><td>Zuführnadel, gerade, 21 G, 1,75 mm olivfarbene Spitze, 40 mm</td><td>Agnthos</td><td>1036</td><td></td></tr><tr><td>Gefriermikrotom Microm HM 400</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>24-Well-Zellkultur-Multiwell-Platten</td><td>Greiner Bio-One</td><td>662160<</td><td></td></tr><tr>td colspan="4">Immunohistochemistry</td></tr><tr><td>Tefal vitacuisine steamer</td><td>Tefal</td><td>VS 4001</td><td></td></tr><tr><td>Netwell 24 mm Polyester-Mesh-Membran-Einsätze</td><td>Corning</td><td>3479</td><td>vorgeladen in 6-Well-Kulturplatten</td></tr><tr><td>Netwell 15 mm Polyester-Mesh-Membran-Einsätze</td><td>Corning</td><td>3477</td><td>vorgeladen in 12-Well-Kulturplatten</td></tr><tr><td>Netwell Kunststoff 6-Well-Trägerkit</td><td>Corning</td><td>3521</td><td>für 24 mm Polyester-Mesh-Membraneinsätze</td></tr><tr><td>Netwell Kunststoff 12-Well-Trägerkit</td><td>Corning</td><td>3520</td><td>für 15 mm Polyester-Mesh-Membraneinsätze</td></tr><tr><td>Vectastain Elite ABC Kit</td><td>Vector Laboratories</td><td>PK-6100</td><td></td></tr><tr><td>DAB (3,3&prime;-Diaminobenzidintetrahydrochloridhydrat)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-5637</td><td>krebserregend, lichtempfindlich</td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Primary antibodies</td></tr><tr><td>Rabbit IgG1 &alpha;-Ki67</td><td>Novocastra/ Leica Biosystems</td><td>NCL-L-Ki67MM1</td><td>DAB 1:400/IF 1:100; erfordert Epitop-Entnahme</td></tr><tr><td>Kaninchen &alpha;-GFAP, AS-3-GF</td><td>Synaptic Systems</td><td>173 002</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Ziegen-IgG (H+L) &alpha;-GFP</td><td>Acris Antikörper</td><td>R1091P</td><td>1:300</td></tr><tr><td>Maus IgG1 &alpha;-Nestin</td><td>Abcam</td><td>ab6142</td><td>1:200; erfordert Epitopgewinnung</td></tr><tr><td>Meerschweinchen IgG (H+L) &alpha;-Doublecortin</td><td>Merck Millipore</td><td>AB2253</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Ratte IgG2a &alpha;- BrdU (Aszites)</td><td>AbD Serotec/ Bio-Rad</td><td>OBT0030CX</td><td>zum Nachweis von BrdU; DAB 1:500/IF 1:400</td></tr><tr><td>Ratte IgG2a &alpha;-BrdU (gereinigt)</td><td>AbD Serotec/ Bio-Rad</td><td>OBT0030&nbsp; &nbsp;</td><td>zum Nachweis von CldU; DAB 1:500/IF 1:250-400</td></tr><tr><td>Maus IgG1 &alpha;-NeuN</td><td>Merck Millipore</td><td>MAB377</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Maus IgG1&#954; &#945;-BrdU</td><td>BD Biosciences</td><td>347580</td><td>Zum Nachweis von IdU; DAB 1:500/IF 1:350<</td></tr><tr>td colspan="4">Sekundäre Antikörper</td></tr><tr><td>Esel &alpha;-Meerschweinchen IgG (H+L)-Biotin</td><td>Dianova</td><td>711-065-152</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Esel &alpha;-Ratte IgG (H+L)-Biotin</td><td>Dianova</td><td>712-065-150</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Esel &alpha;-Maus IgG (H+L)-Biotin</td><td>Dianova</td><td>715-065-151</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Ziege &alpha;-Ratte IgG (H+L)-Alexa Fluor 488</td><td>Molekulare Sonden</td><td>A11006</td><td>1:250</td></tr><tr><td>Esel &alpha;-Ziege IgG (H+L)-Alexa Fluor 488</td><td>Molekulare Sonden</td><td>A11055</td><td>1:250</td></tr><tr><td>Esel &alpha;-Maus IgG (H+L)-FITC, Fab-Fragment</td><td>Dianova</td><td>715-097-003</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Esel &alpha;-Maus IgG (H+L)-Alexa Fluor 647</td><td>Dianova</td><td>715-605-151</td><td>1:250</td></tr><tr><td>Esel &alpha;-Meerschweinchen IgG (H+L)-Alexa Fluor 647</td><td>Dianova</td><td>706-605-148</td><td>1:250</td></tr><tr><td>Esel &alpha;-Ratte IgG (H+L)-Rhodamin Rot-X</td><td>Dianova</td><td>712-295-150</td><td>1:250</td></tr><tr><td>Esel &alpha;-Kaninchen IgG (H+L)-Rhodamin Rot-X</td><td>Dianova</td><td>711-295-152</td><td>1:250</td></tr><tr><td>Esel &alpha;-Meerschweinchen IgG (H+L)-Rhodamin Rot-X</td><td>Dianova</td><td>706-296-148</td><td>1:250</td></tr><tr><td>Streptavidin-Rhodamin Red-X</td><td>Dianova</td><td>016-290-084</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Ziege &alpha;-Kaninchen IgG (H+L)-AMCA</td><td>Dianova</td><td>111-155-144</td><td>1:250, funktioniert nur mit Kaninchen &alpha;-GFAP</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Molekulare Sonden</td><td>H3570</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Molekulare Sonden</td><td>D1306</td><td>1:1000<</td></tr><tr>td colspan="4">Blocking </td></tr><tr><td>Fab-Fragment Esel &alpha;-Maus IgG (H+L)</td><td>Dianova</td><td>715-007-003</td><td>1:20</td></tr><tr><td>Fab-Fragment Esel &alpha;-Kaninchen IgG (H+L)</td><td>Dianova</td><td>711-007-003</td><td>1:20</td></tr><tr><td>Normales Eselserum</td><td>Merck Millipore</td><td>S30</td><td></td></tr><tr><td>Normales Kaninchenserum</td><td>Dianova</td><td>011-000-010</td><td></td></tr><tr><td>Normales Ziegenserum</td><td>Dianova</td><td>005-000-001</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Histology</td></tr><tr><td>Cresylviolet</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5042</td><td></td></tr><tr><td>Neo-Clear</td><td>Merck Millipore</td><td>109843</td><td>ungiftiger Xylolersatz</td></tr><tr><td>Neo-Mount</td><td>Merck Millipore</td><td>109016</td><td>permanentes Einbettmedium</td></tr><tr><td colspan="4">Mikroskopie</td></tr><tr><td>Axioskop 2</td><td>Carl Zeiss Mikroskopie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSM 710</td><td>Carl Zeiss Mikroskopie</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

immunhistochemie und multiple markierung mit antikörper aus dem gleichen host arten, die adult neurogenese studieren

Immunohistochemistry and Multiple Labeling with Antibodies from the Same Host Species to Study Adult Hippocampal Neurogenesis

Neurogenese ist ein stark reguliert, mehrstufiges Verfahren, bei dem neue Neuronen aus einer aktivierten neuronalen Stammzelle über setzen verstärkt Zwischenvorläufertypen erzeugt. Jede dieser Subtypen exprimiert ein Satz spezifischer molekularer Marker, der zusammen mit spezifischen morphologischen Kriterien können für die Identifikation verwendet werden. Typischerweise werden Immuntechniken aufgebracht mit Subtyp-spezifische Antikörper in Kombination mit exo- oder endogenen Proliferationsmarker. Wir beschreiben hier Immunmarkierung Methoden zum Nachweis und zur Quantifizierung von allen Stadien der Erwachsenen Neurogenese. Diese umfassen die Anwendung der Thymidinanaloga, transkardialer Blutung, Gewebeverarbeitung, hitzeinduzierter Epitopdemaskierung, ABC Immunhistochemie, mehrere indirekte Immunfluoreszenz, konfokale Mikroskopie und Zell Quantifizierung. Außerdem eine sequentielle Mehrfachimmunfluoreszenz-Protokoll, das Probleme u umgeht präsentieren wirsually sich aus der Notwendigkeit der Verwendung von primären Antikörpern in den gleichen Wirtsspezies erhöht. Es ermöglicht eine genaue Identifizierung aller Hippocampus-Vorläuferuntertypen zusammen mit einem Proliferationsmarker in einem einzigen Abschnitt. Diese Techniken sind ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Regulierung der unterschiedlichen Vorläufertypen parallel, ihre Beteiligung an der Hirnerkrankungen und deren Rolle in spezifischen Gehirnfunktionen zu untersuchen.

Wir verwendeten die vorstehend beschriebenen zu quantifizieren und zu charakterisieren neugeborenen Zellen in den postnatalen und Hippocampus Methoden. Daher haben wir Wildtyp und Neurogenese-defizienten Cyclin D2 Knock-out (CCND2 KO) Mäuse unter Bedingungen bekannt, die Rate der Neurogenese (dh angereicherten Umgebung, EE) 13,14 beeinflussen gebracht. Immunhistochemische Färbung DAB entweder gegen Ki67, BrdU CldU oder IdU konsistent zeigten unterschiedliche neugeborenen Zellzahlen zwischen ...

Dieser Videoartikel veranschaulicht ein umfassendes Protokoll zum Nachweis und zur Quantifizierung aller Stadien der adulten Hippocampus-Neurogenese innerhalb desselben Gewebeabschnitts. Wir haben eine Methode entwickelt, um die Einschränkungen der indirekten multiplen Immunfluoreszenz zu überwinden, die entstehen, wenn geeignete Antikörper von verschiedenen Wirtsspezies nicht verfügbar sind.

Immunhistochemie und Multiple Markierung mit Antikörper aus dem gleichen Host Arten, die Adult Neurogenese Studieren

Adult neurogenesis is a highly regulated, multi-stage process in which new neurons are generated from an activated neural stem cell via increasingly ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Einschränkungen der indirekten Immunfluoreszenz bei der Untersuchung von neuronalen Vorläuferzellen zu umgehen, wenn geeignete primäre Antikörper aus verschiedenen Wirtsspezies nicht verfügbar sind. Zunächst wird ein Thyminidinanalogon injiziert, um die sich teilenden Zellen zu markieren; anschließend wird das Gewebe entnommen, aufgearbeitet und in Kryoschnitte zerschnitten. Dann wird die sequenzielle mehrfache Immunfluoreszenz gestartet. Ein nicht markierter primärer Antikörper wird aufgetragen, der anschließend von einem fluoreszenzmarkierten sekundären Antikörper gebunden wird. Danach werden die offenen Paratope auf dem ersten sekundären Antikörper mit Serum aus der Art des primären Antikörpers blockiert, und alle Immunglobuline, die vom zweiten sekundären Antikörper erkannt werden könnten, werden mit unkonjugierten Fab-Fragmenten abgedeckt.Dies ermöglicht es, das Gewebe mit einem zweiten primären Antikörper zu behandeln, der durch einen anderen sekundären Antikörper markiert werden kann. Letztendlich werden Bilder der Schnitte verwendet, um die Entwicklung und Regulation neuraler Vorläuferzellen als Reaktion auf spezif

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Das Video zeigt eine Immunfluoreszenz-Färbemethode, die zur Untersuchung der Neurogenese im adulten Hippocampus verwendet wird. Zunächst wird ein Schnitt eines Mausgehirns mit primären Antikörpern behandelt, die auf Markerproteine gerichtet sind, die mit der Neurogenese in neuronalen Vorläuferzellen assoziiert sind. Als nächstes wird es mit Sekundärantikörpern markiert, die mit Fluorophoren markiert sind. Der Hirnschnitt wird dann unter einem konfokalen Mikroskop beobachtet, um verschiedene...

Eine Immunfluoreszenz-Färbetechnik zum Nachweis der adulten Hippocampus-Neurogenese

Dieses Video zeigt das Verfahren zum Färben neu proliferierter neuraler Stammzellen in Hirngewebeschnitten mittels EdU-Inkorporation, gefolgt von Immunfluoreszenz zur Visualisierung spezifischer Proteine, was das Verständnis der Zelldynamik und -proliferation verbessert.

Immunfluoreszenzfärbung zur Visualisierung proliferierter neuraler Stammzellen in Hirnschnitten von Mäusen

Die Lokalisation und Verteilung von Proteinen liefern wichtige Informationen für das Verständnis ihrer zellulären Funktionen. Die überlegene Ortsauflösung der Elektronenmikroskopie (EM) verwendet, um die subzelluläre Lokalisierung eines bestimmten Antigens nach Immunohistochemie bestimmen. Für Gewebe des zentralen Nervensystems (ZNS), Erhaltung strukturelle Integrität während Antigenität war besonders schwierig im EM-Studien. Hier nehmen wir ein Verfahren, das verwendet wurde, um Strukturen und...

Post-Einbettung Immunogoldmarkierung der synaptischen Proteine ​​in Hippocampusschnitt Kulturen

Während der adulten Hippocampus-Neurogenese wird ein bestimmter Satz genetischer Marker exprimiert, wenn eine ruhende neurale Stammzelle nacheinander fortschreitet und sich zu einem funktionell integrierten Neuron im Schaltkreis entwickelt. Mittels hitzeinduzierter Antigengewinnung werden Vorläuferzelltypen, die sonst schwer zu detektieren sind, mit verbesserter Wirksamkeit identifiziert.

Hitzeinduzierte Antigengewinnung: Eine effektive Methode zum Nachweis und zur Identifizierung von Vorläuferzelltypen während der adulten Hippocampus-Neurogenese

Dieses Einführungsprotokoll beschreibt die Reagenzien, Geräte und Techniken, die erforderlich sind, um die immunhistochemische Färbung von Nagetiergehirnen durchzuführen, am Beispiel von Markern für Mikroglia und neuronale Elemente.

Primer für die Immunhistochemie auf gefriergeschnitten Rat Brain Tissue: Beispiel Färbung für Mikroglia und Neuronen

Wir beschreiben ein Immunhistochemie Protokoll, um das Profil Hippocampus-Neuronen Aktivierung nach Exposition gegenüber einer räumlichen Lernaufgabe in einem Maus-Modell gekennzeichnet durch kognitive Defizite der Neuroentwicklungs Ursprung zu studieren. Dieses Protokoll kann sowohl genetische oder pharmakologische Mausmodellen, gekennzeichnet durch kognitive Defizite angewendet werden.

Immunhistochemische Visualisierung von Hippocampus-Aktivität nach Spatial Learning in einem Mausmodell für neurologische Entwicklungsstörungen

Die Lokalisierung der Genexpression auf bestimmte Zelltypen kann aufgrund des Mangels an spezifischen Antikörpern eine Herausforderung darstellen. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur gleichzeitigen dreifachen Detektion der Genexpression durch Kombination von Doppelfluoreszenz-RNA-in-situ-Hybridisierung mit Immunfärbung.

Die Kombination von Doppel-Fluoreszenz<em&gt; In Situ</em&gt; Die Hybridisierung mit Immunmarkierung für Nachweis der Expression von drei Gene in Mäusehirnschnitten

Das Ziel dieses Protokolls ist es, einen Ansatz zur Analyse des Verhaltens von adulten neuronalen Stamm-/Vorläuferzellen als Reaktion auf die chemogenetische Manipulation eines bestimmten lokalen neuronalen Schaltkreises zu beschreiben.

Assaying Circuit Spezifische Regulation von adulthippocampal neuralen Vorläuferzellen

In diesem Artikel werden vier der gebräuchlichsten Techniken zur Visualisierung von BrdU-positiven Zellen vorgestellt, um die adulte Neurogenese bei Ratten zu messen. Diese Arbeit umfasst Anweisungen für die Reagenzienvorbereitung, die Verabreichung von Thymidinanalogonen, die transkardiale Perfusion, die Gewebepräparation, die immunhistochemische Reaktion der Peroxidase, die Immunfluoreszenz, die Signalverstärkung, die Gegenfärbung, die mikroskopische Bildgebung und die Zellanalyse.

Immunhistochemische Techniken zur Analyse der zellulären Proliferation und Neurogenese bei Ratten unter Verwendung des Thymidin-Analogons BrdU

Hier beschreibt das Protokoll, wie man eine doppelte Markierung der Immunfluoreszenz unter Verwendung von primären Antikörpern durchführt, die in derselben Spezies aufgezogen wurden, um Wirt-Pathogen-Interaktionen zu untersuchen. Es kann auch den dritten Antikörper von einem anderen Wirt in diesem Protokoll enthalten. Dieser Ansatz kann in jedem Zelltyp und Pathogen durchgeführt werden.

Doppelmarkierung der Immunfluoreszenz unter Verwendung von Antikörpern derselben Spezies zur Untersuchung von Wirt-Pathogen-Interaktionen

Hier wird eine Methode zur Sequenzierung einzelner Kerne, die aus dem Gyrus dentatus der Maus isoliert wurden, vorgestellt, die die meisten Neuronen durch Fluoreszenz-aktivierte Kerne (FAN)-Sortierung ausschließt. Dieser Ansatz generiert qualitativ hochwertige Expressionsprofile und erleichtert die Untersuchung der meisten anderen Zelltypen, die in der Nische vertreten sind, einschließlich seltener Populationen wie neuraler Stammzellen.

Fluoreszenzaktivierte Kerne negative Sortierung von Neuronen kombiniert mit Einzelkern-RNA-Sequenzierung zur Untersuchung der neurogenen Hippocampus-Nische

Lernen Sie eine sequenzielle Immunfluoreszenzmethode zur Quantifizierung adulte Hippocampus-Neurogenese in Gewebeschnitten. Dieses Protokoll ermöglicht Mehrfachmarkierungen mit Antikörpern gleicher Wirtsarten.

Immunhistochemie und Multiple Markierung mit Antikörper aus dem gleichen Host Arten, die Adult Neurogenese Studieren

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