Aislamiento de leucocitos de la interfaz humana Materno-fetal

El objetivo general de este procedimiento es aislar leucocitos del paral humano, decidua, baus y decidua. Esto se logra diseccionando primero los tejidos humanos de la placenta. A continuación, el tejido decidual se disocia por disgregación mecánica y digestión enzimática.

A continuación, la suspensión celular se filtra utilizando un colador de células de 100 micrómetros lavado con un XPBS y se fuma a 300 G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados para obtener un pellet de células. Finalmente, la suspensión celular se carga sobre la solución de gradiente de densidad y la centrífuga, y se recoge la interfaz que contiene los leucocitos. En última instancia, los leucocitos aislados se pueden utilizar para el inmunofenotipado, el cultivo celular y los estudios funcionales.

La ventaja cerebral de esta técnica o de los métodos existentes, como la disociación mecánica o la digestión enzimática, es que combina la desegregación mecánica de tejidos con un asociador automático de tejidos y la digestión temática con Accutane y el aislamiento de leucocitos mediante un gradiente fecal. Se ha demostrado que este protocolo preserva los antígenos de la superficie celular en la viabilidad celular, y sus implicaciones se extienden hacia la comprensión de las propiedades funcionales y fenotípicas de los leucocitos infiltrantes en la interfaz materno-fetal relacionadas con la patogénesis de las complicaciones prenatales. La recolección y utilización de muestras humanas con fines de investigación fueron aprobadas por las juntas de revisión institucional del Eunice Kennedy Shriver, el Instituto Nacional de Salud Infantil y Desarrollo Humano, los Institutos Nacionales de Salud, el Departamento de Salud y Servicios Humanos y la Universidad Estatal de Wayne.

Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todas las mujeres embarazadas antes de la recolección de muestras de tejido. Yay. Para empezar, los deci basilis diseccionan un trozo de la placa basal de una de las partes principales de la placenta. Colóquelo en una tabla de cortar estéril con el vli placentario, que será de color rojo sangre con una apariencia peluda hacia arriba.

La placa basal es lisa y de color rojo pálido, mientras que mantiene el tejido empapado en una XPBS utiliza tijeras y pinzas afiladas y de punta fina para extraer el tejido velloso y los vasos sanguíneos. Recoja dos o tres piezas y use PBS para enjuagarlas a fondo para eliminar la sangre. Para aislar el deci paral, disecciona la pieza cuadrada de 10 centímetros por 10 centímetros.

Colócalo en el tablero con el corion, que contiene coágulos de sangre y suele ser de color amarillo claro hacia arriba. A continuación, use pinzas de punta fina para eliminar la mayor cantidad posible de coágulos de sangre. Luego, con uno estéril XPBS, enjuague la membrana hasta que el PBS salga transparente.

Con un raspador de células estériles desechable y mientras coloca PBS en la membrana, raspe suavemente la capa decidual. Recoger los tejidos deci y colocarlos en un tubo de plástico de 50 mililitros con PBS estéril para desagregar mecánicamente la decidua Bali o el deci paral. Comience usando un XPBS estéril para lavar el tejido en un tubo de 50 mililitros.

A continuación, centrifugar el tejido a 300 g y temperatura ambiente durante cinco minutos. Aspire con cuidado el sin alterar el pellet. Luego, después de suspender el tejido y la solución de desprendimiento, de acuerdo con el protocolo de texto, transfiera los tejidos homogeneizados a un tubo C.

Coloque el tubo en el disociador automático y ejecute el programa correspondiente después de la disociación en una solución de desprendimiento de células disponible comercialmente, como Accutane en los tejidos, incube a 37 grados centígrados con agitación suave durante 45 minutos para digerirlo. Después de la incubación, agregue 10 mililitros de PBS a la mezcla de digestión y pásela a través de un colador de celdas de 100 micrómetros a un tubo de 50 mililitros. Dependiendo de la pegajosidad, pueden ser necesarios varios coladores para colar una digestión.

Utilice PBS para llenar el tubo y centrifugar a 300 g y temperatura ambiente durante cinco minutos. Retire con cuidado el sobrenadante S y use cinco mililitros de tampón de fax helado para resuspender la pastilla de celda. Para estudiar leucocitos mononucleares, agregue cinco mililitros de medio de gradiente de densidad del 20% a un tubo de plástico de 15 mililitros.

A continuación, superponga lentamente la suspensión de la célula en la parte superior, teniendo cuidado de no permitir que las capas se mezclen con una centrífuga de rotor oscilante a 500 G a cuatro grados centígrados y sin la pausa durante 30 minutos, se encontrarán leucocitos en la interfaz entre el medio de gradiente de densidad y el búfer de fax. A continuación, pipetee con cuidado la capa superior que contiene el búfer de fax y los restos de celda. La interfaz contiene las células mononucleares residuales y una parte de los leucocitos polimorfonucleares.

Transfiere esta capa a un nuevo tubo de 15 mililitros. Añada al menos tres volúmenes de tampón de fax al tubo y, a continuación, centrifugar a 300 g durante cinco minutos. Para paladar las células, aspire el sobrenadante S y lave las células con tampón fax por segunda vez antes de realizar el cultivo celular de las células.

Clasificación e inmunofenotipado según el protocolo de texto, esta figura muestra una morfología de macrófagos aislados recolectados de las parias de decidua en un embarazo a término utilizando clasificación magnética de células. Los macrófagos aislados mantienen la capacidad de liberar citocinas después de tres días de cultivo. El rendimiento de las células viables aisladas de la decidua, baus y decidua paral se determinó siguiendo la separación en gradiente de densidad.

Utilizando una viabilidad fijable como se muestra aquí, fue superior al 90% para cada población de deci células. Aquí se muestra la estrategia de compuerta para analizar leucocitos polimorfonucleares y mononucleares dentro de la compuerta visible, incluidos los linfocitos T, neutrófilos, macrófagos, linfocitos NK, linfocitos NK y linfocitos B. En el embarazo a término, esta figura muestra neutrófilos, macrófagos, células T y células B de células residuales aisladas de un embarazo a término.

Por último, en este conjunto de gráficos se representan las células NK, NKT y T procedentes de células residuales aisladas de un embarazo a término. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en tres horas si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar limpiar bien el tejido, evitar la contaminación de la sangre y mantener el cóctel de tejido y enzimas en los ojos durante el procedimiento.