gingivalis Porphyromonas כאורגניזם מודל להערכת אינטראקציה של חיידקים אנאירוביים עם תאי מארח

המטרה הכוללת של סרטון זה היא להדגים פרוטוקולים להערכת האינטראקציה של חיידקים אנאירוביים עם תאים מארחים. התנאים המשמשים לגידול תאים אריים רעילים לחיידקים אנאירוביים ולהיפך. זה מציב אתגר בחקר האינטראקציות שלהם ויש להשיג תנאים אופטימליים לשניהם כדי שהם יישארו פעילים מטבולית במהלך תקופת המחקר.

תנאים כאלה ישקפו בצורה מדויקת יותר את התרחיש של אינטראקציה עם פתוגן מארח שנמצא in vivo. השיטה המוצגת כאן תעזור לענות על שאלות הנוגעות למנגנונים המעורבים בהישרדות חיידקים כמו גם קשירה והפנמה של תאי חיידקים אנאירוביים במהלך זיהום. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שעבודה עם חיידקים אנאירוביים דורשת ידע בתא אנאירובי וטכניקות ספיגה טובות.

הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שקשה ללמוד את השלבים הכרוכים בשימוש בתא אנאירובי. כמו כן, יש לנקוט משנה זהירות בעת ניסויים בתאים אנאירוביים לתרבית ולניסויים עם ג'ינג'יס מבשר רעות. תא אנאירובי ויניל נשמר עם אווירה מלאכותית המכילה 80% חנקן, 10% מימן ו-10% פחמן דו חמצני מניחים 30 צלחות אגר דם, 500 מיליליטר PBS ו -30 מיליליטר של גורם גדילה אנדותל כלי דם או מדיום VEGF בתוך החדר האנאירובי.

24 שעות מראש כדי לאזן את זרע הריאגנטים ארבע פעמים 10 לחמשת תאי האנדותל של וריד הטבור האנושי או VE לכל באר בשש צלחות באר במדיום VEGF ולהשאיר אותם בחממת תרבית התאים למשך הלילה לחיבור. הכינו תרביות פורו ג'ינגיס בעירוי לב מוח, או מדיום BHI כמתואר בטקסט הנלווה ואפשרו לתרביות להגיע לשלב היומן כאשר הצפיפות האופטית של התרבית ב-660 ננומטר נעה בין 0.5 ל-0.7. העבירו את החיידקים לצינור של 15 מיליליטר ועטפו חתיכת פרפורם סביב הכובע כדי למנוע סגירה אירובית.

לאחר מכן צנטריפוגה של החיידקים ב -5, 000 פעמים G למשך 10 דקות בתוך החדר האנאירובי. שוטפים את החיידקים הגלולים עם PBS אנאירובי וסובבים שוב ב -5, 000 פעמים G למשך 10 דקות. לריס יש את החיידקים במדיום VEGF כדי להדביק את ה-HU X בהעברה מבשרת רעות.

שש צלחות הבאר מהחממה לתא האנאירובי שואבות את המדיום מבארות הבדיקה ושוטפות שלוש פעמים עם PBS אנאירובי קבע את מספר התא מבאר מייצגת אחת על ידי בדיקת אי הכללה כחולה טריאן. לאחר מכן הוסיפו שני מיליליטר לבאר של מדיום VEGF אנאירובי והניחו את הצלחות בחום של 37 מעלות צלזיוס בחממה האנאירובית למשך 20 דקות. כדי לאזן, קבע את הצפיפות האופטית של החיידקים וההחייאה.

השעו אותם בנפח מספיק של מדיום VEGF כדי להדביק תאים בריבוי זיהום של 100 לאחד חיידקים לתאים. הוסף את תרחיף החיידקים לתאים ודגירה למשך 30 דקות ב-37 מעלות צלזיוס לזיהום לליזה תאים בתוך החדר האנאירובי. הכן תמיסת ספונין של 1% משקל לנפח במדיום BHI וסנן דרך מסנן של 0.2 מיקרון כדי לחקור אינטראקציות חיידקים עם תאי מארח.

הסר את צלחת שש הבארות מהחממה ושאף את המדיום הזיהומי. יש לשטוף שלוש פעמים עם PBS אנאירובי. לאחר מכן הוסיפו שני מיליליטר תמיסת ספונין לכל באר ודגרו למשך 15 דקות כדי לאפשר ליזה של תאים.

לאחר מכן, מגרדים את התאים מתחתית הבאר ומדללים את הליזאט של התא אחד לאחד עם מדיום BHI. לאחר מכן בצע דילולים סדרתיים החל מאחד עד 100, צלח 200 מיקרוליטר של דילול מתאים על צלחות אגר דם. עוטפים את הצלחות בפרפיל ומדגרים אותן בחממה אנאירובית של 37 מעלות צלזיוס למשך שבעה ימים כדי לאפשר היווצרות מושבה.

לאחר מכן באמצעות קופסת אור ספרו את היחידות היוצרות מושבה או CFUs על כל צלחת בעקבות זיהום של תאי HU E. שטפו את התאים שלוש פעמים עם PBS אנאירובי. לאחר מכן, הוסף שני מיליליטר של מדיום VEGF בתוספת ריכוזים אופטימליים מראש של אנטיביוטיקה לתאי HU E.

דגרו על התאים למשך שעה, שאפו את המדיום והוסיפו שני מיליליטר של תמיסת 1% ספונין ב- BHI לכל באר דגירה למשך 15 דקות. לאחר מכן, מגרדים את התאים הליזים ואוספים את הליזאט בצינור צנטריפוגה. מדללים את הליזט אחד לאחד עם מדיום BHI, ואז מכינים דילולים סדרתיים החל מאחד עד 100.

צלחת 200 מיקרוליטר מהריכוזים המתאימים על הדם. צלחות אגר. אפשרו לחיידקים לגדול במשך שבעה ימים בתא אנאירובי ואז ספרו את המושבות.

שיטת הציפוי המתוארת מתייחסת רק לחיידקים החיים שמקיימים אינטראקציה עם התאים. על מנת להתגבר על החיסרון הזה, אנו משתמשים במיקרוסקופיה שבה ניתן לדמיין חיידקים חיים ומתים בקשר של התא כדי לדמיין חיידקים מופנמים. חיטוי העברה אספטי ראשון.

מכסה הזכוכית מחליק בתוך כל באר של צלחת צלחת 12 בארות, חמש פעמים 10 לארבע יש לבאר על הכיסוי. החליקו ודגרו למשך 24 שעות כדי לתייג חיידקים, צנטריפוגה, מידלוק, חיידקי פאזה, והשעו שוב את הגלולה עם צנטריפוגה PBS אנאירובית וחזרו על שלב הכביסה. הוסף 20 מיקרוליטר של 0.2 מילי-מולרי B-C-E-C-F-A-M לשני מיליליטר PBS אנאירובי המכיל חמש עד שבע פעמים 10 לשמינית.

חיידקים למיליליטר דוגרים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות בחושך. הצבע הפלואורסצנטי בו אנו משתמשים יכול להכתים את רוב החיידקים האנאירוביים, ולכן אין צורך בריאגנטים אחרים כגון נוגדן ספציפי. צנטריפוגה את תרחיף החיידקים ב -5, 000 פעמים G למשך 10 דקות כדי להסיר את מגיב התיוג הלא קשור ולהשעות מחדש את החיידקים במדיום VEGF.

לאחר מכן להדביק את תאי ה-UIC ביחס של 100 לחיידק אחד לתאים ולדגור ב-37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר הדגירה, הסר את המדיום הזיהומי ושטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS. לאחר מכן מוסיפים 4% פרלדהיד ודוגרים בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.

כדי לתקן את התאים בתא האנאירובי, הסר את התאים הקבועים מהתא ולאחר מכן שטוף את החלקות הכיסוי עם PB S3 פעמים דגר את החלקות הכיסוי במיליליטר אחד של 0.2% טריטון X 100 למשך 10 דקות כדי לחלחל לתאים. לאחר מכן שטפו את החלקות הכיסוי עם PB S3 פעמים עכשיו. הוסף 50 מיקרוליטר של 50 מיקרוגרם למיליליטר של פויד T-R-I-T-C לכל כיסוי, החלק ודגירה במשך 45 דקות בטמפרטורת החדר כדי להכתים אקטין אוליגומרי תאי.

לאחר הדגירה יש לשטוף את החלקת הכיסוי עם PB S3 פעמים. הפוך את פתק הכיסוי על שקופית זכוכית עם מדיום הרכבה רך המכיל מיקרוגרם אחד למיליליטר dappy לצביעה גרעינית. לאחר מכן אטמו את היקף החלקת הכיסוי עם לק והתבוננו באינטראקציה מיקרוסקופית קונפוקלית של החיידק האנאירובי.

ג'ינגיס נקבובי עם uve מוצג בתוצאות אלה. דילול סדרתי של התא, ליזאט המכיל תא המחובר או חיידקים מופנמים פי 100 הניב מספר ניתן למנייה של CFUs על צלחות אגר הדם. שבעה ימים לאחר הדגירה מוצגת כאן השוואה של תפוקת CFU על צלחות אגר בין זיהום ב-porus vallis W 83 לבין מחיקה מוטנטית V 315

המוטציה משפיעה על יכולתו של החיידק להדביק. VE שמוצג כאן הוא ייצוג גרפי של מושבות החיידקים שהתקבלו מתאים נגועים. כאשר האינטראקציה הוערכה, פחות חיידקים מוטנטיים התאוששו מתאים נגועים בהשוואה לזן מסוג פראי.

תוצאות המתקבלות לאחר הריגת החיידקים החוץ-תאיים על ידי טיפול אנטיביוטי מוצגות בעמודות הימניות. שוב, הזן המוטנטי לא היה יעיל בפלישה לתאי uve חיים. חיידקים נצפים עם תיוג עם BCE CFAM.

צביעה נוספת של חוטי האקטין וגרעין התא נראית בפלואורסצנציה אדומה וכחולה בהתאמה. לאחר שליטה, כל אחת מהטכניקות הללו יכולה להיעשות תוך שש שעות אם מבוצעת כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לשמור על החיידקים בתנאים אנאירוביים וכן להשוות את כל המדיה והאספקה בתא האנאירובי עד 24 שעות לפני הניסוי.

אל תשכח שעבודה עם פתוגנים אנאירוביים עלולה להיות מסוכנת ביותר ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון לבישת כפפות, שטיפת ידיים ושימוש בטכניקות ספיגה בעת ביצוע הליך זה. כך ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי פתוגנים קדם-שיניים. ניתן ליישם אותו גם על מערכות אחרות כגון אספירציה, דלקת ריאות, זיהומים תוך בטניים, זיהומים גינקולוגיים ועוד זיהומים אנאירוביים רבים הנמצאים באתרים שונים בגוף האדם.

ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על הטיפול התרופתי שלנו בפתוגנים אנאירוביים שונים מכיוון שניתן להוסיף בקלות אמצעים מעכבים לפרוטוקול ולהפנמה הנמדדת ישירות לאחר הטיפול. לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד לתרבית חיידקים אנאירוביים ולהעריך את יכולתם לקיים אינטראקציה עם תאים מארחים.