ヒト下垂体腺腫細胞の三次元アルギン酸ビーズ文化

この方法の全体的な目標は、ヒト下垂体腺腫細胞を維持するための三次元アルギン酸ビーズ培養物を説明することです。この方法は、浸潤性のさまざまなマーカーの発現など、腫瘍細胞生物学分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、アルギン酸足場が他の三次元系とは対照的に、下垂体腺腫細胞がアルギン酸ビーズから改善してさらなる調査を行うことを可能にすることです。

その手順を実演するのは、私の研究室の研究助手であるCarmen Solano-Agamaです。まず、層流キャビネット内で作業しながら、以前に取得した腺腫腫瘍組織を、約20ミリリットルのカルシウムおよびマグネシウムを含まないPBSを含む35ミリメートルの皿に入れます。外科用ピンセットを使用して、組織を新鮮なPBSを含む別のペトリ皿に移し、組織を洗浄します。

赤血球と破片が除去されるまで、新しいバッファーへの転写を繰り返します。次に、外科用ピンセットで下垂体腺腫組織を保持し、小さな手術用ハサミで組織を細かく切ります。次に、エッジが丸みを帯びたパスツールピペットを使用して、組織片と緩衝液を15ミリリットルのチューブに移します。

68 g で室温で 10 分間遠心分離します。スピン後、パスツールピペットを使用してPBSを取り出し、3〜5ミリリットルのコラゲナーゼ溶液を加えます。チューブを反転させて2〜3回混合し、コラゲナーゼ内の組織を摂氏37度で30分間一定回転させてインキュベー

チューブを再度10分間遠心分離し、パスツールピペットを使用してコラゲナーゼ溶液を除去します。5ミリリットルのTNaseを加え、反転させて2〜3回混合した後、再度サンプルを遠心分離します。組織が完全に解離していない場合は、テキストプロトコルに従って2回目の酵素消化を行います。

次に、上澄みを吸引して捨てます。次に、1容量のEGTA溶液を使用してペレットを再懸濁し、2容量のアルギン酸溶液と穏やかに混合します。21ゲージの針が入った滅菌シリンジからプランジャーを取り外し、ピペットを使用してアルギン酸塩と細胞結合液をシリンジにロードします。

プランジャーをシリンジにそっと挿入し、シリンジの針を塩化カルシウム溶液から約5センチメートルのビーカーに置きます。次に、アルギン酸細胞懸濁液をビーカーに一滴ずつ慎重に分注します。懸濁液は、溶液と接触するとピクピクと動き、球状のビーズを形成します。

円を描くように、ガラスビーカーをゆっくりとかき混ぜて、ビーズがくっつかないようにします。次に、アルギン酸ビーズを塩化カルシウム溶液に5分間保持します。インキュベーション後、カルシウム溶液を慎重に取り出し、FBSを20%豊富に含むM199を3〜5ミリリットル使用してビーズを2回洗浄します。

滅菌ヘラで、アルギン酸ビーズを通常のT25組織培養フラスコに移し、FBSを含むM199を4〜5ミリリットル加えます。加湿インキュベーターで5%の二酸化炭素と摂氏37度でインキュベートします。ポリ-D-リシンコーティングされたカバースリップを調製した後、テキストプロトコルに従って。

アクチン細胞骨格を解析するには、ピペットを使用して、培養フラスコから1ミリリットルのアルギン酸ビーズを15ミリリットルのチューブに移します。5ミリリットルの55ミリモルクエン酸ナトリウムを加え、室温で68倍gで10分間遠心分離します。次に、上清を吸引し、捨てます。

20%FBSを豊富に含む1ミリリットルの温かいM199を使用して、ペレットを懸濁し、細胞懸濁液を穏やかに混合します。次に、テキストプロトコルに従って細胞を数えた後、直径13ミリリットルのポリD-リシンコーティングガラスカバースリップに35,000個の細胞を播種します。細胞を48時間インキュベートした後、培地を取り出し、PBSを使用して細胞を一度洗浄します。

次に、固定バッファーのカバーガラスあたり500マイクロリットルを加えて細胞を固定および透過化し、摂氏37度で10分間インキュベートします。固定バッファーを取り外し、PBS中の3.5%パラホルムアルデヒドのカバーガラスあたり500マイクロリットルを追加します。その後、室温で30分間インキュベートしてから、溶液を取り出します。

最後に、細胞を洗浄し、ローダミン結合ファロイジンとdapi溶液でインキュベートした後、テキストプロトコルに従って、主観63倍と励起波長541の共焦点レーザー走査型顕微鏡を使用して、アクチン細胞骨格の画像を取得します。この図は、3か月後にアルギン酸ビーズに埋め込まれた下垂体腺細胞を示しています。ここに示すように、細胞は倒立光学顕微鏡下で複屈折性の丸みを帯びた形状を示します。

この図では、アルギン酸に包埋されたラット下垂体腺腫細胞におけるN-カドヘリンの局在が見られます。N-カドヘリンは細胞間接触に局在し、核はクロマチンが伸長した状態を示します。この実験では、Ki67に対する免疫反応性を用いて、機能していないヒト下垂体腺腫10例から増殖指数を求め、平均標識指数19.2±1.5%を求めました。

ここで、非侵襲的細胞のアクチン細胞骨格は、小さなアクチンストレス繊維を持つ細長い形状を示しました。より多くのフォラージュとアクチンフィラメントの配置は、培養系とは無関係に下垂体腺腫によって異なりました。例えば、機能していない浸潤性腺腫では、これらの細胞の主な形状は丸みを帯びており、アクチンフィラメントの不連続な皮質リングが特徴的であった。

習得すると、一次下垂体腺腫の培養は3時間で完了します。アルギン酸塩のカプセル化は、適切に行えば15分で行うことができます。この手順を試みるときは、アルギン酸細胞溶液の流れとカルシウム溶液の表面との衝突による固い真珠や死んだ細胞を避けるために、針をカルシウム溶液から5センチメートル以内に維持することを覚えておくことが重要です。

この手順に続いて、アルギン酸ビットの固定、それに続くポリエチレングリコールによる脱水などの他の方法を実行して、下垂体腺腫細胞がこの3次元足場で細胞骨格をどのように組織化するかなどの追加の質問に答えることができます。このビデオを見れば、三次元アルギン酸ビーズ培養で下垂体腺腫細胞を維持する方法についてよく理解できるはずです。