Dissection de tissu gonadique Larval Zebrafish

L’objectif global de cette procédure est d’isoler le tissu gonadique des larves de poisson-zèbre et d’analyser les propriétés moléculaires du tissu isolé. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du développement sexuel du poisson-zèbre. Comme la conservation des gènes dans la régulation du développement des gonades et les fondements moléculaires du développement sexuel du poisson-zèbre. Le principal avantage de cette technique est que les tissus gonadiques des larves de poisson-zèbre peuvent être disséqués dès 17 jours après la fécondation pour déterminer l’état biologique cellulaire et moléculaire.

En général, les individus novices dans cette méthode auront du mal en raison de la petite taille et du remodelage dynamique des tissus gonadiques chez les larves de poisson-zèbre. Pour se préparer à la dissection gondale, transférez deux poissons-zèbres adultes mâles et deux femelles de chaque côté d’un bassin de franchissement divisé. Le lendemain matin, rafraîchissez l’eau du réservoir et retirez la barrière pour commencer l’accouplement.

Une à deux heures après la fécondation, collectez et transférez une quarantaine d’ovules dans une plaque de 100 millimètres avec 40 millilitres de milieu embryonnaire, ou EM. Incuber les embryons à 28,5 degrés Celsius pendant quatre jours, en rafraîchissant l’EM deux fois par jour. Après l’incubation, transférez les larves dans des réservoirs d’un litre. Après cinq jours après la fertilisation, ou DPF, donnez des rotifères vivants aux poissons.

Lorsque les larves atteignent dix DPF, nourrissez les poissons avec des artémias vivants. Ensuite, à 14 DPF, transférez le poisson dans un système d’eau de recirculation. Augmentez les larves de poisson-zèbre à 17 ou 25 DPF.

Mesurez ensuite la longueur du corps des larves à 17 et 25 DPF. Préparez des plaques de gélose à deux pour cent pour la dissection en ajoutant quatre grammes de gélose à 200 millilitres d’eau stérile. Faites chauffer le mélange au micro-ondes jusqu’à ce qu’il devienne transparent.

Laissez refroidir l’agar pendant 15 minutes, puis versez-le dans des boîtes de Pétri de 60 millimètres de diamètre. Conservez les plaques de gélose solidifiée à quatre degrés Celsius. Pour anesthésier, les larves de 17 DPF ajoutent de la glace pilée dans le réservoir.

Transférez les larves anesthésiées dans une boîte de Pétri réfrigérée de 100 millimètres avec 30 millilitres de solution froide de Ringer. Incuber le poisson dans la solution de Ringer réfrigérée pendant au moins 15 minutes pour anesthésier complètement les larves. À l’aide d’une cuillère en plastique, transférez les larves dans une plaque de gélose pré-refroidie.

Immergez tout le corps du poisson dans dix millilitres de solution Ringer’s réfrigérée et posez-le doucement sur le côté. Sous un stéréomicroscope, à un grossissement de 25x, utilisez une pince à épiler pour serrer le tronc du poisson afin de le stabiliser. Ensuite, avec une autre pince à épiler, déchirez l’abdomen longitudinalement de l’anus au cœur.

Ensuite, retirez doucement la peau et les muscles d’un côté du corps pour exposer les organes internes. Ensuite, retirez soigneusement les organes massifs ventrals du nappe. Évitez d’endommager la gonade attachée à la vessie natatoire.

Coupez la connexion entre la vessie natatoire et l’intérieur du corps. Ensuite, retirez soigneusement toute la vessie natatoire et le tissu gonadique. À l’aide d’une pince à épiler, séparez soigneusement le tissu gondal de la vessie natatoire.

Et nettoyez le tissu adipeux environnant. Transférez immédiatement le tissu gonadique isolé dans un tube à centrifuger pré-refroidi de 1,5 millilitre, contenant 200 microlitres de solution de Ringer. Gardez le tube sur de la glace jusqu’à ce que tous les tissus gonadiques soient séparés des larves.

Pour extraire l’ARN total du tissu gonadique larvaire, transférez les gonades isolées dans un nouveau tube de 1,5 millilitre sans RNase et retirez la solution de Ringer. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de solution de lyse. Et tournez le tube jusqu’à ce que le tissu soit complètement lysé.

Après avoir effectué une extraction totale de l’ARN, selon les instructions du fabricant, ajoutez un dixième du volume du tampon DNase I et un microlitre de DNase I à la solution d’ARN, et mélangez doucement le contenu du tube. Incuber l’échantillon à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes. Ensuite, ajoutez un dixième du volume du réactif d’inactivation de la DNase à la solution d’ARN.

Incuber l’échantillon à 70 degrés Celsius pendant dix minutes. Ensuite, utilisez un spectrophotomètre pour mesurer la concentration de l’ARN total. Pour effectuer la synthèse de l’ADNc du premier brin, utilisez une amorce de liaison oligo-dT et un à deux microgrammes d’ARN pour effectuer la synthèse de l’ADNc du premier brin, en suivant le protocole du fabricant.

Incuber la réaction à 45 degrés Celsius pendant 90 minutes. Ensuite, terminez la réaction en chauffant l’échantillon à 70 degrés Celsius pendant cinq minutes. Ajoutez un microlitre de RNase H à la solution d’ADNc pour éliminer l’ARN résiduel.

Mélangez doucement le contenu du tube et centrez l’échantillon à environ 13 000 fois G pendant dix secondes. Incuber le tube à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes. Ensuite, ajoutez 20 microlitres d’eau libre neuclétique à l’échantillon.

Et stockez l’ADNc à moins 70 degrés Celsius. Enfin, utilisez un colorant fluorescent pour effectuer la QCPR en utilisant la condition et les amorces énumérées dans le protocole de texte. Cette figure montre le tissu gonadique typique du poisson-zèbre lavaral à 17 DPF.

La gonade est attachée à la face ventrale de la vessie natatoire, comme on le voit ici. À 17 DPF, les larves contiennent les gonades gauche et droite, qui sont translucides. Dans la plupart des cas, les gonades sont entourées de tissu épithélial et de protonéphridium.

À 25 DPF, la gonade est souvent enveloppée de tissu adipeux, et des gonades grandes ou petites peuvent être observées. Enfin, pour analyser les propriétés moléculaires du tissu gonadique isolé, les niveaux d’expression des marqueurs gonadiques amh, cyp19a1a, nanos3 et vasa ont été examinés par QPCR. Les résultats montrent une augmentation significative des gènes marqueurs dans le tissu gonadique par rapport au tissu contrôlé.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en une heure si elle est exécutée correctement. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de fournir des conditions d’élevage constantes pour les larves de poisson-zèbre, car il est essentiel d’obtenir les résultats attendus. Après son développement, cette technique a ouvert la voie à des recherches dans le domaine du développement sexuel pour explorer les mécanismes de détermination du sexe du poisson zèbre.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler les tissus gonadiques des larves de poisson-zèbre.