Dissection du cœur chez les larves, le poisson zèbre juvéniles et adultes, Danio rerio

L’objectif global de cette procédure est de retirer le cœur du poisson zèbre. Ceci est accompli en collectant et en fixant d’abord des poissons-zèbres. Ensuite, la cavité corporelle est ouverte pour visualiser le cœur.

Ensuite, le cœur est retiré et nettoyé des tissus non cardiaques. Enfin, le cœur est photographié. En fin de compte, la morphologie du cœur au fil du temps peut être vue par microscopie, coupe et photographie.

La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle en tant que clé de la dissection. Les sta sont difficiles à apprendre car les poissons zèbres sont petits et les tissus ne sont pas de couleur distincte et peuvent être difficiles à identifier pour générer des poissons zèbres à partir des larves jusqu’aux stades adultes. Pour ces expériences, effectuez des accouplements individuels ou en groupe avec des poissons adultes.

Nettoyez les embryons et conservez-les dans un incubateur à 28 degrés Celsius. Cinq jours après la fécondation, séparez les poissons dans des aquariums à une densité de 10 à 15 poissons et placez-les dans l’installation de poisson. Retirez le poisson de son aquarium à l’âge approprié et placez-le dans 0,2 % Trica pour l’anesthésier.

Placez le poisson anesthésié dans de l’eau glacée pendant 15 minutes pour l’euthanasier. Pendant ce temps, ajoutez 4 % de paraformaldéhyde ou de PFA dans un XPBS dans un plat. Incuber le poisson recueilli dans le PFA à 4 % pendant une à deux heures à température ambiante, puis toute la nuit à quatre degrés Celsius dans une boîte de Pétri enveloppée de perfil.

Cela maintient le poisson à plat et rend la dissection beaucoup plus facile après la fixation. Rincer deux fois dans du PBS avec 0,1 %Les poissons préadolescents ou PBT peuvent être conservés dans du PBT à quatre degrés Celsius jusqu’à 10 jours. Placez un seul poisson dans une boîte de Pétri, à moitié remplie de PBS frais et posez-le sur son côté droit.

Mesurez la longueur du poisson du museau à la base de la queue, sans compter les nageoires caudales, à l’aide d’un pied à coulisse numérique millimétrique. Il s’agit de la longueur standard ou sl. Attribuez à chaque poisson une combinaison de lettres numériques pour permettre de suivre un poisson individuel et le cœur disséqué qui en résulte pour une analyse ultérieure.

Entrez toutes les données, y compris toutes les mesures, dans une feuille de calcul et organisées en fonction de ces étiquettes avant la dissection. Étiquetez les bandelettes de tubes PCR avec le numéro de suivi attribué et remplissez les tubes avec du PVT ou une autre solution appropriée pour une analyse plus approfondie. Orientez le site ventral du poisson vers le haut dans une boîte de Pétri tout en stabilisant le corps avec des pinces, en tenant la tête entre les yeux et les branchies pour les poissons de moins de 12 millimètres de longueur standard.

À l’aide d’une pince tranchante ou d’une micro-aiguille dans un porte-épingle. Retirez les muscles pectoraux et les nageoires du corps pour révéler le cœur. Le mouvement constant de la pince pendant la dissection peut provoquer des courants dans le PPT qui déplacent le poisson.

Ceci est particulièrement problématique pour les petits poissons. Ainsi, une micro-aiguille doit être utilisée pour retirer les muscles pectoraux et la nageoire et ouvrir la cavité corporelle. À l’aide de la pince, retirez doucement le cœur de la cavité sous l’oreillette.

Si le poisson contient un marqueur cardiaque fluorescent, utilisez un endoscope fluorescent pour la dissection et vérifiez l’ablation du cœur par fluorescence. Une fois le cœur retiré de la cavité, utilisez la pince pour tenir le cœur et une micro-aiguille pour retirer le tissu non cardiaque supplémentaire et la muqueuse épicardique de l’extérieur du cœur. Pour les poissons de plus de 12 millimètres de longueur standard.

À l’aide de micro-ciseaux à ressort, faites trois incisions. Tout d’abord, faites une coupe transversale à travers les branchies. Deuxièmement, faites une autre coupe transversale à l’avant du ventre.

Et troisièmement, faites une coupe sagittale sur le côté ventral reliant les deux coupes transversales. À l’aide d’une pince tranchante, retirez les muscles pectoraux et les nageoires du corps pour ouvrir la cavité corporelle et révéler le tissu argenté du péricarde. Retirez ce tissu péricardique et le cœur deviendra visible.

Utilisez les micro-ciseaux pour couper l’artère reliée au bulbus artériel situé au-dessus du cœur. Une fois cette artère coupée, placez les pointes de la pince sous l’oreillette et utilisez la pince pour retirer le cœur de la cavité. S’il y a du tissu supplémentaire qui vient avec le cœur, ce n’est pas grave car il peut être enlevé plus tard.

Alternativement, chez certains poissons, il est possible d’enlever le cœur en tirant doucement le bulbus et le reste du cœur suivra. Faites attention à l’emplacement de l’oreillette si vous utilisez la technique alternative car elle peut facilement être endommagée. S’il y a du tissu supplémentaire qui vient avec le cœur, c’est bien et peut être éliminé après.

Une fois le cœur retiré de la cavité, utilisez les deux pinces pour tenir le cœur et retirer le tissu supplémentaire ou une paire de pinces pour maintenir le cœur et une micro-aiguille pour retirer le tissu non cardiaque supplémentaire. Pour photographier le cœur du poisson-zèbre, préparez une boîte de Pétri de gélose nutritive de 23 grammes par litre et recouvrez la gélose solidifiée de PBS. Utilisez la pince pour faire un puits dans la gélose qui permet au cœur de s’adapter dans la bonne orientation.

Retirez le cœur du tube PCR en tenant l’extrémité du bulbe. Avec la pince fermement. Placez le cœur dans le plat à agar.

Orientez le cœur dans la gélose pour photographier. L’échantillon peut être tourné après chaque image dans toutes les orientations possibles. Utilisez la hauteur, la lumière et des temps d’exposition courts pour photographier les cœurs.

Ajustez la qualité de la lumière en utilisant l’exposition si nécessaire pour obtenir la meilleure photo. Un exemple d’un cœur pur bien disséqué est montré ici. Chaque cœur aura quelques différences dans la morphologie globale, mais le cœur devrait être complet contenant un ventricule intact, un oreillette et une artériose bulbeuse après son développement.

Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine du développement cardiaque du poisson-zèbre pour explorer la maturation cardiaque à différents stades du développement du poisson-zèbre.