幼生ゼブラフィッシュ性腺組織の解剖

この手順の全体的な目標は、ゼブラフィッシュの幼虫から性腺組織を単離し、単離された組織の分子特性を分析することです。この方法は、ゼブラフィッシュの性発達分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。生殖腺の発達を調節する遺伝子の保存や、ゼブラフィッシュの性発達の分子基盤などです。この技術の主な利点は、受精後17日という早い時期にゼブラフィッシュの幼虫の性腺組織を解剖して、細胞生物学的状態と分子生物学的状態を確認できることです。

一般的に、この方法に不慣れな個体は、ゼブラフィッシュの幼生の性腺組織のサイズが小さく、動的にリモデリングされるため、苦労するでしょう。ゴンダル分裂の準備として、2匹のオスと2匹のメスの成魚を分割された交差タンクの両側に移します。翌朝、タンクの水をリフレッシュし、バリアを取り除き、交配を開始します。

受精後1〜2時間で、約40個の卵子を集めて、40ミリリットルの胚培地(EM)を入れた100ミリメートルプレートに移します。胚を摂氏28.5度で4日間インキュベートし、EMを1日2回リフレッシュします。インキュベーション後、幼虫を1リットルのタンクに移します。受精後5日後、またはDPFは、生きたワムシを魚に与えます。

幼虫が10DPFに達すると、魚に生きたブラインシュリンプを与えます。次に、14 DPFで、魚を再循環水システムに移します。ゼブラフィッシュの幼生を17DPFまたは25DPFに上げます。

次に、幼虫の体長を17DPFと25DPFで測定します。200ミリリットルの滅菌水に4グラムの寒天を加えて、解剖用の2パーセント寒天プレートを準備します。混合物を電子レンジで透明になるまで加熱します。

寒天を15分間冷やし、直径60mmのシャーレに注ぎます。固化した寒天プレートは摂氏4度で保管します。麻酔をかけた17匹のDPF幼虫に、砕いた氷をタンクに加えます。

麻酔をかけた幼虫を、30ミリリットルの冷たいリンガー溶液を入れた100ミリメートルの冷やしたペトリ皿に移します。冷やしたリンガー溶液で魚を少なくとも15分間インキュベートして、幼虫を完全に麻酔します。プラスチック製のスプーンで、幼虫を予冷した寒天プレートに移します。

魚の体全体を10ミリリットルの冷やしたリンガー液に浸し、そっと横に置きます。実体顕微鏡で、25倍の倍率で、ピンセットを使用して魚の幹を固定し、安定化させます。次に、別のピンセットで、腹部を肛門から心臓まで縦に引き裂きます。

次に、体の片側の皮膚と筋肉をやさしく取り除き、内臓を露出させます。次に、スイムブローダーの腹側にある巨大な臓器を慎重に取り除きます。水泳用膀胱に付着した生殖腺を傷つけないようにしてください。

水泳用ブラダーと内部ボディの間の接続を切断します。次に、水泳用膀胱全体と性腺組織を慎重に引き出します。ピンセットを使用して、水泳用膀胱からゴンダル組織を慎重に分離します。

そして、周囲の脂肪組織をきれいにします。分離された性腺組織を、200マイクロリットルのリンゲル液を含む予冷済みの1.5ミリリットルの遠心分離チューブに直ちに移します。すべての性腺組織が幼虫から分離されるまで、チューブを氷の上に置いておきます。

幼虫の性腺組織から全RNAを抽出するには、単離された生殖腺を新しいRNaseを含まない1.5ミリリットルチューブに移し、リンゲル液を除去します。次に、100マイクロリットルの溶解液を加えます。そして、組織が完全に溶解するまでチューブをボルテックスします。

全RNA抽出を行った後、製造元の指示に従って、10分の1の容量のDNase Iバッファーと1マイクロリットルのDNase IをRNA溶液に加え、チューブの内容物を穏やかに混合します。サンプルを摂氏37度で20分間インキュベートします。次に、10分の1の容量のDNase不活性化試薬をRNA溶液に加えます。

サンプルを摂氏70度で10分間インキュベートします。次に、分光光度計を使用して全RNAの濃度を測定します。ファーストストランドcDNA合成を行うには、オリゴ-dTリンカープライマーと1〜2マイクログラムのRNAを使用して、メーカーのプロトコルに従ってファーストストランドcDNA合成を行います。

反応を摂氏45度で90分間インキュベートします。次に、サンプルを摂氏70度で5分間加熱して反応を終了します。RNase Hを1マイクロリットルのRNase HにcDNA溶液に加えて、残留RNAを除去します。

チューブの内容物を穏やかに混合し、サンプルを約13, 000倍のGで10秒間センターフュージします。チューブを摂氏37度で20分間インキュベートします。次に、20マイクロリットルの中核性遊離水をサンプルに加えます。

そして、cDNAをマイナス70°Cで保存します。最後に、蛍光色素を使用して、テキストプロトコルに記載されている条件とプライマーを使用してQCPRを実施します。この図は、17 DPFのラバラルゼブラフィッシュの典型的な性腺組織を示しています。

生殖腺は、ここに見られるように、水泳用膀胱の腹側に付着しています。17 DPFでは、幼虫には半透明の左右の生殖腺が含まれています。ほとんどの場合、生殖腺は上皮組織と原腎に囲まれています。

25 DPFでは、生殖腺は脂肪組織に包まれていることが多く、大小の生殖腺が観察される場合があります。最後に、単離された性腺組織の分子特性を解析するために、性腺マーカーamh、cyp19a1a、nanos3、およびvasaの発現レベルをQPCRで調べました。その結果、制御組織と比較して、生殖腺組織のマーカー遺伝子が有意に増加していることが示されています。

このテクニックをマスターすると、適切に実行すれば1時間で完了できます。この手順を試みる際には、期待される結果を得るために重要であるため、ゼブラフィッシュの幼生に一貫した飼育条件を提供することを覚えておくことが重要です。開発後、この技術は、ゼブラフィッシュの性決定メカニズムを探求するための性発達分野の研究への道を開きました。

このビデオを見た後、ゼブラフィッシュの幼生から性腺組織を分離する方法をよく理解しているはずです。