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Overview

Per sezionare processi genetici o creare organismi con nuove suite di tratti, gli scienziati possono eseguire incroci genetici o l'accoppiamento intenzionale di due organismi. La ricombinazione del materiale genetico parentale nella prole consente ai ricercatori di dedurre le funzioni, le interazioni e le posizioni dei geni.

Questo video esaminerà come le croci genetiche sono state influenti nello sviluppo delle tre leggi di ereditarietà di Mendel, che costituiscono la base della nostra comprensione della genetica. Una tecnica di incrocio genetico che è stata sviluppata per la prima volta per organismi unicellulari come il lievito, nota come analisi tetrade, sarà poi presentata in dettaglio, seguita da alcuni esempi di come questo strumento classico viene utilizzato negli studi genetici di oggi.

Procedure

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Un incrocio genetico è l'accoppiamento intenzionale di due individui con conseguente combinazione di materiale genetico nella prole. Le croci possono essere eseguite in molti sistemi modello, tra cui piante, lieviti, mosche e topi, e possono essere utilizzate per sezionare processi genetici o creare organismi con nuovi tratti.

Questo video coprirà alcuni dei principi delle croci genetiche, esaminerà un metodo per eseguire incroci noto come analisi tetrade e discuterà diverse applicazioni di questa tecnica.

Innanzitutto, introduciamo i principi di base dell'ereditarietà che rendono possibili gli incroci genetici.

Il fenotipo di un organismo, o composizione dei tratti, è influenzato dal suo corredo genetico o genotipo. Nella maggior parte degli organismi che si riproducono sessualmente, la generazione parentale produce cellule gametiche aploidi, che hanno una copia di ciascun cromosoma distinto. Questi poi si fondono durante l'accoppiamento per produrre una prole diploide con due copie omologhe di ciascun cromosoma. Se entrambi i cromosomi contengono lo stesso allele, o forma variante di un gene, allora l'organismo è "omozigote" in quel locus genetico; altrimenti, è "eterozigote".

Per ricominciare il ciclo, l'organismo diploide genera nuovamente gameti aploidi tramite meiosi. Durante questo processo, i due cromosomi omologhi subiscono una "ricombinazione", in cui vengono scambiati bit di sequenze equivalenti tra la coppia. Questo processo mescola gli alleli parentali ereditati da ogni prole, aumentando così la loro diversità genetica.

Una delle prime persone a effettuare incroci genetici sistematici è stato il "padre della genetica", Gregor Mendel. Usando la pianta di piselli facilmente manipolabile ed esaminando una serie di tratti con modelli coerenti di ereditarietà, Mendel fu in grado di derivare tre leggi fondamentali di ereditarietà che avrebbero costituito la base della genetica.

La prima legge di Mendel è la Legge dell'Uniformità, che afferma che la progenie eterozigote della prima, o F1, generazione di due individui omozigoti avrà il fenotipo di un solo genitore. L'allele che stabilisce questo fenotipo è chiamato "dominante", mentre l'allele "nascosto" è "recessivo". Ora sappiamo che le relazioni di dominanza sono spesso meno chiare, con casi come la dominanza incompleta, in cui gli eterozigoti esprimono un fenotipo misto; e codominance, dove vengono visualizzati entrambi i fenotipi.

La legge di segregazione afferma che un allele è assegnato in modo casuale a ciascun gamete. Osservando che la progenie F2 dell'autofecondazione di individui eterozigoti F1 mostrava un rapporto fenotipico 3:1, ma che due degli individui fenotipicamente dominanti sono in realtà eterozigoti, Mendel dedusse che i due alleli parentali devono essere ereditati separatamente. Oggi sappiamo che la segregazione si verifica durante la meiosi, quando i due cromosomi omologhi del genitore diploide sono divisi casualmente in cellule figlie aploidi, ognuna ereditando uno dei due alleli.

La terza legge di Mendel è la Legge dell'Assortimento Indipendente, che afferma che i tratti individuali sono ereditati in modo indipendente. Ora sappiamo che l'indipendenza assoluta esiste solo per i tratti controllati da geni su cromosomi separati nell'insieme aploide, che sono distribuiti indipendentemente alle cellule figlie durante la meiosi. Per due geni sullo stesso cromosoma, la distanza tra loro è inversamente proporzionale alla probabilità che vengano ricombinati su cromosomi omologhi diversi e, per estensione, alla probabilità che siano ereditati insieme nella stessa prole. Pertanto, l'analisi dei quattro prodotti meiotici di un organismo diploide fornisce agli scienziati un modo per mappare la posizione dei geni.

Dopo aver esaminato i principi alla base delle croci genetiche, diamo un'occhiata a un protocollo per l'analisi della tetrade.

Questa tecnica viene tipicamente applicata a determinate alghe o funghi unicellulari, come il lievito, per sezionare i quattro prodotti meiotici aploidi, o spore, che in queste specie rimangono insieme come una "tetrade" all'interno di un corpo a singola cellula.

Per eseguire l'analisi tetrad nel lievito, i ceppi desiderati vengono prima coltivati su mezzi appropriati. Le cellule di lievito provenienti da singole colonie possono accoppiarsi, ad esempio strisciando ogni ceppo in un motivo incrociato su una nuova piastra. Questa piastra viene quindi replicata su supporti selettivi per isolare solo il prodotto diploide della croce.

Cellule diploidi selezionate vengono coltivate su mezzi poveri di nutrienti per indurre la sporulazione e la formazione di tetradi. Gli asci, che sono le strutture che contengono le tetradi delle spore, vengono digeriti in soluzioni contenenti l'enzima zimolyase. Dopo la digestione, i singoli asci vengono manipolati utilizzando un microscopio sezionante tetrad. Sono disposti in posizioni specifiche su una piastra di crescita e interrotti per liberare le singole spore. Questi possono essere collocati in un modello a griglia, in cui ogni spora genererebbe una singola colonia che può essere ulteriormente analizzata.

Ora che sai come viene eseguita l'analisi tetrade, esaminiamo alcune delle molte applicazioni o modifiche di questa tecnica.

La dissezione manuale delle tetradi richiede molto tempo e i ricercatori hanno ideato alternative ad alto rendimento, come il sequenziamento delle tetradi abilitato ai codici a barre. In questo metodo, la progenie diploide di una croce di lievito è stata trasformata con una libreria di plasmidi, ognuno dei quali contiene una breve sequenza unica nota come "codice a barre" che funge da identificatore per ogni progenie. I plasmidi esprimono anche GFP, consentendo di selezionare gli asci di lievito tramite citometria a flusso e smistare su piastre di agar. Gli asci venivano lasati in massa sui piatti e alle spore veniva permesso di crescere in piccole colonie. Le colonie sono state poi distribuite in modo casuale a piastre a 96 pozzetti per la genotipizzazione. L'esclusivo codice a barre di sequenza consente ai ricercatori di raggruppare le quattro colonie sorte dalle spore di ciascuna tetrade.

Le croci genetiche possono anche essere utilizzate per generare cellule di lievito con un gran numero di delezioni geniche. Nel processo del mostro verde, il lievito mutante aploide che trasporta diverse delezioni geniche contrassegnate da GFP viene accoppiato e sporulato. Queste progenie aploidi, alcune delle quali portano delezioni ereditate da entrambi i genitori, sono ordinate tramite citometria a flusso attivata dalla fluorescenza, in cui l'intensità della GFP è stata dimostrata correlata al numero di delezioni presenti in un particolare ceppo di lievito. Queste cellule selezionate sono state poi coltivate e ri-incrociate. La ripetizione di questo ciclo ha generato ceppi di lievito contenenti numerose delezioni.

Infine, le croci genetiche sono state adattate per l'uso in molti sistemi modello, come il parassita intracellulare che causa la malaria Plasmodium. Poiché il parassita può riprodursi solo all'interno di altre cellule, tutte le fasi di attraversamento devono essere eseguite rispettivamente nei topi o nelle zanzare, l'ospite naturale e il vettore del parassita. Qui, i topi sono stati infettati da due ceppi unici di Plasmodium nella fase del parassita del sangue. I parassiti venivano poi trasferiti nelle zanzare attraverso l'alimentazione del sangue, e una volta dentro maturavano in gameti che si fertilizzavano per formare zigoti diploidi. Gli sporozoiti maturi sono stati poi raccolti dalla zanzara e utilizzati per infettare topi ingenui, dove i parassiti sono stati propagati per isolare la progenie incrociata di interesse.

Hai appena visto il video di JoVE sulle croci genetiche. In questo video, abbiamo introdotto i principi di ereditarietà, come gli incroci genetici in alcuni organismi possono essere analizzati con la dissezione tetradale e alcune applicazioni attuali. Come sempre, grazie per aver guardato!

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