Overview
マイクロ アレイ遺伝子発現プロファイリングのための重要なツールし、ガラス チップに接続されているプローブと核酸サンプルから派生した相補的な結合に基づいています。これらの配列を使用して、科学者は遺伝子の何千もの式を同時に評価できます。さらに、さまざまな細胞や組織の種類の発現プロファイル比較、異なる遺伝子の発現がどのように生物学的プロセスの間に変更を推測する研究者を許可することができます、ので、経路やネットワークで遺伝子が機能する方法に洞察力を得る。
ここでは、ゼウスは、マイクロ アレイの背後にある原理を説明します。これは、マイクロ アレイ実験とマイクロ アレイ データを分析する簡単な紹介を実行するための一般的なプロトコルが続きます。我々 は科学者が現在重要な生物学的問題を研究する癌と非癌組織から派生した別のセル型間の遺伝子発現を比較する例のためのマイクロ アレイを使用して方法の議論を終了します。
Procedure
DNA のマイクロ アレイは、多くの異なる遺伝子の発現を同時に測定する広く使用されるツールです。彼らは大量のプローブで構成されて-それぞれ異なる遺伝子-「チップ」やスライドに固定化した、さまざまな生物学的条件における遺伝子発現を評価する相補的な交配に依存します。
このビデオでは、マイクロ アレイ技術、遺伝子発現のマイクロ アレイ、およびいくつかの現在のアプリケーションを使用するためのプロトコルの基本原則をカバーします。
遺伝子発現プロファイリングとマイクロ アレイ技術の原則を議論することから始めましょう。
生体試料中の遺伝子発現を評価するために開発された最も早い方法の 1 つは北しみが付くこと、膜に固定化した特定の RNA 分子の「プローブ」を含むです。「フローティング」プローブはサンプルでは、相補的な rna を認識し、視覚化できるように通常放射性か蛍光分子が付いています。
微細加工、ゲノム配列解析および他の技術の進歩は、マイクロ アレイ ・ バイオチップの開発につながっています。北のしみのようなマイクロ アレイは、核酸配列をプローブとサンプル間の相補的な結合の原理に基づいています。異なり Northerns、しかし、マイクロ アレイそれはオリゴヌクレオチド プローブをスライド ガラスまたはチップに固定されています。「フローティング」サンプル RNA 由来の細胞から生成または相補的または"c"には関心の生物逆転写-DNA。これは、できますか直接標識する蛍光分子またはその金額は cRNAの生体外のトランスクリプションによってさらに増幅される可能性があります。サンプルは、チップにそれから交配です。さまざまなアプリケーション用に設計されたマイクロ アレイのプローブがありますいずれかの「感覚」のシーケンスは、同じ方向に生物の RNA、または「アンチセンス」の表現を意味するので、サンプルの繊維方向がプローブの相補的な研究者する必要がありますを確認します。
チップ上の遺伝子特定ドットごとに「生」蛍光強度データの定量化および処理できます。データは、学生の t テストのかどうか蛍光信号を決定するように、さらに統計的テストを受けることができます- およびこうして式レベル-興味の遺伝子が 2 つの細胞の種類や実験条件の間に有意な。
研究者はまた、「クラスター」またはグループの遺伝子表現の類似パターンに基づいて、このデータを使用できます。たとえば、2 つの細胞集団間の発現パターンを比較すると、ある特定の遺伝子が表現の変更を示すためほぼ等量によって同じ方向にある、こうしてまとめてでしょう。研究者は、ツリー図やハイツと「枝」の手配が示す「デンドロ グラム」のタイプのこれらの関係を描写できる同様の方法- または異種-遺伝子発現パターンが。このタイプの分析は、「クラスター化された」遺伝子が同じ生物学的経路に参加できるよう遺伝子ネットワークに洞察力を提供できます。
今、我々 はマイクロ アレイの方法の原則を説明してきた、典型的なマイクロ アレイ実験を見てをみましょう。
隔離された RNA の品質を確保するためワークスペースおよび装置が RNases を不活化できる化学薬品と扱われるべき-それ以外の場合、RNA を破壊する酵素。RNA は興味のサンプルから分離し、精製し、その濃度と整合性は吸光光度法を通じて決定されます。
このサンプルの RNA は、cDNA、し cRNA に変換されます。次に、サンプルの蛍光分子をラベル付けし、断片化しているし、その質と量再度チェックできます、その時点で蛍光ラベル化の程度を評価するも。
標識 cRNA 混合し、マイクロ アレイにロードする前に「交配ソリューション」です。成功した交配をさせるためには、「ミキサー」がフォーム」交配の部屋」にチップに配置します。交配の組合せは、ゆっくりとは配列に追加されます。これらは、マイクロ アレイ上の特定の領域にサンプルのバインドに干渉でき、偽否定的な信号が発生、気泡を避けるために注意する必要があります。サンプルを追加すると、チップが 24 時間適切な温度で培養しました。
交配後ミキサーはチップから削除されます、バインドされていないサンプルを洗い落とし、および配列は特殊なスライドを保持、遠心分離機で遠心分離によって完全に乾燥します。乾燥チップ マイクロ アレイ スキャナーに挿入し、マシンは、チップに観測された明るい信号が過剰飽和ではないので調整。マイクロ アレイは、スキャンして、チップ全体のイメージが生成されます。
チップをスキャンすると、画像ファイルはデータ抽出ソフトウェアに読み込まれ、任意の信号の不規則性の評価。マイクロ アレイ画像から抽出したデータはログ2変換、数値倍の増加の面でデータを表現するための研究者をことができます、または遺伝子発現の減少、統計的な操作の数に服従します。正規化、およびマイクロ アレイ チップの信号の違いを占めます。これは、データを処理し、さらに分析します。
今、我々 はマイクロ アレイで発現プロファイリングを実行する方法を説明した、マイクロ アレイを使用して、特定の実験の方法を見てみましょう。
研究者は多くの場合遺伝子の発現がどのように細胞の分化などの生物学的プロセスを通して変化を評価するためのマイクロ アレイを採用しています。ここでは、科学者は、22 ヌクレオチド網膜開発のさまざまな段階を表す 3 つのひと細胞タイプの遺伝子発現を調整に関与する低分子 Rna であるマイクロ Rna のレベルを評価しました。これらの細胞間のマイクロ Rna 発現を比較すると、研究者は可能性のある網膜組織の分化に関与する遺伝子を特定できた。
マイクロ アレイは、さまざまな細胞や組織の種類の式の違いを評価するためにも使用できます。この実験では、心的外傷後ストレス障害や PTSD の齧歯動物モデルは電気ショックにラットを公開することによって設立されました。ニューロンは、異なる脳の領域から収集された、RNA が分離されました。マイクロ アレイ、PTSD の背後にある複雑な分子メカニズムに洞察力を提供するこれらのニューロンのミトコンドリア関連遺伝子の発現を識別するために使用されました。
最後に、研究者も適用されますマイクロ アレイを期待して、ガンの研究にその新しい疾患のバイオ マーカーを識別することができます。結果として私たちの進化全体にウイルスによる感染症は、ヒトのゲノムには「内因性レトロ ウイルス」またはいくつかは、まだ積極的に表されます ERVs と呼ばれるウイルスの遺伝子配列が含まれます。ここでは、癌と正常の前立腺組織における発現 ERVs はマイクロ アレイを用いて比較した.このメソッドは、研究者がそれらの病気の診断に使用することができます潜在的なバイオ マーカーを作る前立腺癌の誘導をされたいくつかの ERVs を特定できました。
マイクロ アレイを用いた遺伝子発現にゼウスのビデオを見てきただけ。このビデオでは、発現プロファイル、この手法の適用のためのプロトコル、マイクロ アレイの技術の基本原則を覆われています。いつも見てくれてありがとう!
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