יצירת פרופיל ביטוי עם מיקרו-עריות

מיקרואוריות DNA הן כלים בשימוש נרחב כדי למדוד בו זמנית את הביטוי של גנים רבים ושונים. הם מורכבים מאלפי בדיקות – שכל אחת מהן מייצגת גן אחר – משותקות על "שבבים" או שקופיות, ונחשות על הכלאה משלימה כדי להעריך ביטוי גנים בתנאים ביולוגיים שונים.

וידאו זה יכסה את העקרונות הבסיסיים של טכנולוגיית microarray, פרוטוקול ליצירת פרופיל ביטוי גנים באמצעות microarrays, וכמה יישומים נוכחיים.

בואו נתחיל בדיון בעקרונות של פרופיל ביטוי גנים וטכנולוגיית מיקרו-ערה.

אחת השיטות המוקדמות ביותר שפותחו להערכת ביטוי גנים בדגימות ביולוגיות היא סופג צפוני, הכולל "בדיקה" עבור מולקולות RNA ספציפיות משותקות על ממברנות. בדיקות "צפות חופשיות" מזהות רצפי RNA משלימים במדגם, ומסומנות בדרך כלל במולקולות רדיואקטיביות או פלואורסצנטיות, כך שניתן לדמיין אותם.

ההתקדמות במיקרו-פיבריות, ריצוף הגנום וטכנולוגיות אחרות הובילה לפיתוח הביו-שבב המיקרו-עראי. בדומה לכתמים צפוניים, מיקרו-עראיות מבוססות על העיקרון של כריכה משלימה בין רצפי חומצות גרעין מדגמיות. בניגוד לצפוניים, עם זאת, במיקרו-אריות, הגשושיות של אוליגונוקלאוטיד הן שמשותקות על מגלשת זכוכית או שבב. הדגימות "הצפות חופשיות" נוצרות מרנ"א מבודדות מתאים או אורגניזמים בעלי עניין, שהוא הפוך מתומלל ל- משלים או "c"-DNA. זה יכול להיות מתויג ישירות עם מולקולות פלואורסצנטיות, או הכמויות שלהם עשוי להיות מוגבר עוד יותר על ידי תמלול במבחנה לתוך cRNA. לאחר מכן המדגם הוא היברידי לשבב. מכיוון שבדיקות על מיקרו-עראיות המיועדות ליישומים שונים עשויות להיות "היגיון", מה שאומר שהרצפים שלהם באותו כיוון כמו הרנ"א המבוטא של אורגניזם, או "אנטיסנס", החוקרים חייבים לוודא שהכיוון של הגדיל של המדגם משלים לזה של הבדיקות.

לאחר מכן ניתן לכמת ולעבד את נתוני עוצמת הפלואורסצנטיות "הגולמיים" עבור כל נקודה ספציפית לגן בשבב. הנתונים יכולים להיות כפופים למבחנים סטטיסטיים נוספים, כמו מבחן t של התלמיד, כדי לקבוע אם אותות הפלואורסצנטיות - ולכן רמות הביטוי - עבור גן מעניין שונות באופן משמעותי בין שני סוגי תאים או תנאי ניסוי.

חוקרים יכולים גם להשתמש בנתונים אלה כדי "אשכול" או לקבץ גנים המבוססים על דפוסי ביטוי דומים. לדוגמה, בעת השוואת דפוסי ביטוי בין שתי אוכלוסיות תאים, ניתן למצוא גנים מסוימים כדי להדגים שינויי ביטוי בכמויות שוות בערך באותו כיוון, וכך יקובצו יחד. חוקרים יכולים לתאר קשרים אלה בסוג של דיאגרמת עץ או "דנדרוגרמה" שבהם גבהים וסידורים של "ענפים" מציינים עד כמה דומים – או שונים – דפוסי ביטוי גנים. סוג זה של ניתוח יכול לספק תובנה על רשתות גנים, כמו גנים "מקובצים באשכולות" עשויים להשתתף באותם מסלולים ביולוגיים.

עכשיו כשדיברנו על העקרונות של מתודולוגיית המיקרו-אריה, בואו נסתכל על ניסוי מיקרו-ארי טיפוסי.

כדי להבטיח את איכות הרנ"א המבודד, יש לטפל בסביבות עבודה ובציוד בכימיקלים המנטרלים RNases – אנזימים שאחרת היו הורסים את הרנ"א. לאחר מכן ה- RNA מבודד מדגימות של עניין ומטוהר, והריכוז והשלמות שלו נקבעים באמצעות ספקטרופוטומטריה.

RNA מדגם זה מומר ל- cDNA ולאחר מכן cRNA. לאחר מכן, המדגם מסומן עם מולקולות פלואורסצנטיות מקוטעות, ואת איכותו וכמותו ניתן לבדוק שוב, ואז ניתן גם להעריך את היקף תיוג הפלואורסצנטי.

לאחר מכן, ה-cRNA המסומן מעורבב עם "פתרון הכלאה" לפני הטעינה למיקרו-array. כדי להקל על הכלאה מוצלחת, "מערבל" ממוקם על השבב כדי ליצור "תאי הכלאה". תמהיל ההיברידיות מתווסף לאט למערך. יש להקפיד להימנע מבועות אוויר, שכן אלה יכולים להפריע לקשירת המדגם לאזורים ספציפיים במיקרו-array, ולהוריד אות שלילי כוזב. לאחר הוספת המדגם, שבבים הם דגירה בטמפרטורה המתאימה עד 24 שעות.

לאחר ההיברידיות, המיקסר מוסר מהשבב, דגימה לא מאוגדת נשטפת, והמערך מיובש ביסודיות על ידי צנטריפוגה בצנטריפוגה מיוחדת, מחזיקת שקופיות. השבב המיובש מוחדר לסורק microarray, והמכונה מותאמת כך שהאותות הבהירים ביותר שנצפו בשבב אינם רוויים יתר על המידה. לאחר מכן נסרק המיקרו-אריה, ותמונה של השבב כולו מיוצרת.

לאחר שהשבב נסרק, קובץ התמונה נטען לתוכנת חילוץ נתונים ומוערך עבור אי סדרים באות. נתונים המופקים מתמונת המיקרו-array נתונים למספר מניפולציות סטטיסטיות, כולל טרנספורמציה_{של יומן 2,} המאפשרת לחוקרים לתאר נתונים באופן מספרי במונחים של קיפול או ירידות בביטוי הגנים; כמו גם נורמליזציה, אשר מהווה הבדלי אות בין שבבי microarray. לאחר מכן ניתן לנתח נתונים מעובדים אלה.

כעת, לאחר שהדגמנו כיצד מתבצע פרופיל ביטוי עם מיקרו-arrays, בואו נבחן כיצד ניתן להשתמש במיקרו-arrays בניסויים ספציפיים.

חוקרים משתמשים לעתים קרובות microarrays כדי להעריך כיצד ביטוי גנים משתנה לאורך תהליך ביולוגי, כגון הבחנה תאית. כאן, מדענים העריכו את רמות המיקרו-רנ"א, שהן RNAs קטנות של 22 נוקלאוטידים המעורבות בביטוי גנים לכוונון עדין, בשלושה סוגי תאים אנושיים המייצגים שלבים שונים של התפתחות רשתית. על ידי השוואת ביטוי מיקרו-רנ"א בין תאים אלה, החוקרים הצליחו לזהות גנים שעשויים להיות מעורבים בהבחנה ובהתפתחות של רקמת הרשתית.

Microarrays יכול לשמש גם כדי להעריך הבדלי ביטוי בין תאים שונים או סוגי רקמות. בניסוי זה, מודל מכרסמים של הפרעת דחק פוסט טראומטית, או PTSD, הוקם על ידי חשיפת חולדות לזעזועים חשמליים. נוירונים נאספו מאזורי מוח שונים ורנ"א היה מבודד. מיקרו-אריות שימשו אז לזיהוי ביטוי דיפרנציאלי של גנים הקשורים למיטוכונדריה בתאי עצב אלה, ומספקים תובנה על המנגנונים המולקולריים המורכבים שמאחורי PTSD.

לבסוף, החוקרים מיישמים גם מיקרו-אריות על מחקרי סרטן, בתקווה שניתן יהיה לזהות סמנים ביולוגיים חדשים של מחלות. כתוצאה מזיהומים על ידי וירוסים לאורך האבולוציה שלנו, הגנום האנושי מכיל רצפים גנטיים ויראליים המכונים "רטרווירוסים אנדוגניים" או ERVs, שחלקם עדיין באים לידי ביטוי באופן פעיל. כאן, הביטוי של ERVs ברקמות הערמונית הסרטניות והנורמליות הושווה באמצעות microarrays. שיטה זו אפשרה לחוקרים לאתר מספר ERVs שהיו upregulated בסרטן הערמונית, מה שהופך אותם סמנים ביולוגיים פוטנציאליים שניתן להשתמש בהם כדי לאבחן מחלות.

הרגע צפית בסרטון של ג'וב על פרופיל ביטוי גנים באמצעות מיקרו-עראים. וידאו זה כיסה את העקרונות הבסיסיים של טכנולוגיית microarray, פרוטוקול ליצירת פרופיל ביטוי ויישומים של טכניקה זו. כמו תמיד, תודה שצפית!