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Overview

Tra i diversi metodi per valutare l'espressione genica, il sequenziamento ad alto rendimento dell'RNA o RNA-seq. è particolarmente interessante, in quanto può essere eseguito e analizzato senza fare affidamento sulle precedenti informazioni genomiche disponibili. Durante l'RNA-seq, l'RNA isolato da campioni di interesse viene utilizzato per generare una libreria di DNA, che viene quindi amplificata e sequenziata. In definitiva, l'RNA-seq può determinare quali geni sono espressi, i livelli della loro espressione e la presenza di eventuali trascritti precedentemente sconosciuti.

Qui, JoVE presenta i principi di base alla base dell'RNA-seq. Discutiamo quindi le fasi sperimentali e analitiche di un protocollo generale RNA-seq. Infine, esaminiamo come i ricercatori stanno attualmente utilizzando RNA-seq, ad esempio, per confrontare l'espressione genica tra diversi campioni biologici o per caratterizzare le interazioni proteina-RNA.

Procedure

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Il sequenziamento dell'RNA, o RNA-seq, è una tecnica in grado di fornire informazioni sulla sequenza e la quantità di ogni RNA espresso, noto come "trascrittoma", in una popolazione cellulare. A differenza di altri metodi di profilazione dell'espressione come i microarray, che comportano il sondaggio per sequenze di RNA note, l'RNA-seq può profilare l'espressione genica da organismi con genomi non sequenziati. Inoltre, l'RNA-seq può misurare con precisione una gamma più ampia di livelli di espressione del trascritto rispetto ai microarray, specialmente a livelli molto bassi o molto alti.

Questo video coprirà i principi di RNA-seq, un protocollo per la preparazione di una libreria RNA-seq e l'analisi dei dati, e alcune applicazioni di questa tecnica.

Per prima cosa, esaminiamo alcuni principi alla base dell'RNA-seq. Il sequenziamento del trascrittoma richiede l'isolamento di una popolazione di trascritti i cui livelli devono essere misurati. La maggior parte dell'RNA nelle cellule è l'RNA ribosomiale, o rRNA, il componente centrale del meccanismo di produzione proteica della cellula. Per facilitare il recupero di altri tipi di trascritti, l'rRNA viene in genere rimosso prima del sequenziamento ibridando il campione a oligonucleotidi complementari attaccati a perle magnetiche e utilizzando un magnete per separare l'rRNA dal resto del campione.

In alternativa, è possibile selezionare una popolazione specifica di RNA per il sequenziamento. Ad esempio, gli RNA messaggeri codificanti per proteine, o mRNA, possono essere catturati con "oligo-dT" - brevi tratti di nucleotidi deossi-T che si legano alla sequenza di basi A nota come coda poli-A alla fine di questi trascritti. L'rRNA contaminante viene quindi rimosso. I microRNA, che sono RNA regolatori a 22 nucleotidi, possono essere isolati selettivamente per il sequenziamento in base alle loro dimensioni. Poiché l'RNA è intrinsecamente incline alla degradazione, viene prima trascritto inversamente nel DNA a doppio filamento.

Le sequenze di oligonucleotidi note come adattatori vengono quindi ligate sui frammenti di DNA. Gli adattatori contengono regioni costanti che fungono da siti di legame del primer per la successiva amplificazione della PCR, e queste sono solitamente asimmetriche in modo da preservare lo "strandedness" del modello. Gli adattatori contengono anche sequenze uniche, note come "codici a barre", che identificano tutti i frammenti provenienti da un singolo campione. La libreria viene poi amplificata dalla PCR.

Un chip di sequenziamento, su cui sono presenti oligonucleotidi complementari agli adattatori, viene utilizzato per immobilizzare il campione di libreria, che viene diluito in modo tale che le molecole di DNA si ricotturano sul chip a bassa densità. Il DNA viene amplificato sul chip attraverso un processo chiamato "amplificazione del ponte" per formare "cluster clonali". Brevi frammenti, ciascuno di 30-150 basi di lunghezza, vengono quindi sintetizzati da una o entrambe le estremità di questi modelli di DNA, generando centinaia di milioni di prodotti noti come letture di sequenziamento.

I risultati del sequenziamento vengono quindi analizzati per la qualità e i dati vengono elaborati. L'analisi delle sequenze può rivelare un'ampia varietà di informazioni, comprese le differenze nei livelli di espressione degli RNA tra i campioni e i trascritti o le forme di trascrizioni precedentemente sconosciuti.

Ora che abbiamo visto come funziona l'RNA-seq, esaminiamo un protocollo per preparare una libreria RNA-seq e analizzare i dati della sequenza. L'RNA viene prima ottenuto dal campione di interesse e la sua qualità viene controllata mediante elettroforesi, ad esempio utilizzando un dispositivo di microfluidica chiamato bioanalizzatore. L'RNA deve essere di alta qualità per risultati di sequenziamento accurati. Per garantire l'assenza di contaminazione del DNA, la RT-PCR per un gene espresso viene condotta con o senza trascrittasi inversa. Non ci dovrebbero essere prodotti in assenza di trascrittasi inversa.

Per selezionare l'RNA poli-A, i campioni sono legati a sonde oligo-dT attaccate a perline magnetiche. L'RNA selezionato viene frammentato in 200 pezzi nucleotidici ad alta temperatura in presenza di ioni magnesio, riducendo i bias dipendenti dalla lunghezza nelle successive reazioni e analisi. I frammenti vengono quindi convertiti in DNA a doppio filamento e gli adattatori vengono legati. La libreria è amplificata dalla PCR e la sua qualità viene controllata su un bioanalizzatore e dall'esecuzione di qPCR. I risultati del bioanalizzatore dovrebbero rivelare un picco di prodotti alle dimensioni previste in base alla dimensione media del frammento e alla lunghezza degli adattatori.

Librerie di campioni diversi, contenenti diversi adattatori con codice a barre, possono essere miscelate insieme, insieme a un campione di DNA di riferimento aggiunto a bassa concentrazione come controllo di qualità per le fasi successive del processo, come la generazione di cluster clonali e le reazioni di sequenziamento. La miscela viene aggiunta a un chip di sequenziamento e caricata nella macchina.

Durante la reazione di sequenziamento viene monitorata la densità dei cluster di DNA: non deve essere troppo alta, che può portare a contaminazione incrociata, o troppo bassa, che può portare a dati insufficienti. La qualità del sequenziamento è data dal punteggio Q, che indica la probabilità che venga identificata una base errata. I punteggi Q per la maggior parte delle basi dovrebbero essere maggiori di 30, il che corrisponde a una probabilità inferiore a 1 su 1000 per una lettura errata. Il recupero delle sequenze di DNA di riferimento alla velocità prevista indica che tutte le sequenze della libreria sono rappresentate in modo uniforme.

Le letture generate dal sequenziamento vengono quindi sovrapposte tra loro per dedurre l'RNA che è stato sequenziato. Per gli organismi con informazioni sul genoma disponibili, le letture possono essere allineate al genoma di riferimento. Il numero di letture per trascrizione viene contato per misurare l'abbondanza di ciascun RNA.

Dopo aver visto come funziona l'RNA-seq, diamo un'occhiata ad alcuni modi in cui viene utilizzato.

Il sequenziamento del trascrittoma può identificare geni che sono espressi in modo differenziale in condizioni diverse. Ad esempio, in questo esperimento, sono stati confrontati i trascrittomi delle larve di zanzara prodotte in diverse condizioni di crescita. Anche se questa particolare specie di zanzara portatrice di malattie non ha un genoma sequenziato, i ricercatori sono stati in grado di confrontare le informazioni sul trascrittoma ottenute con altre specie sequenziate e identificare geni con livelli di espressione aumentati o diminuiti.

L'RNA-seq può anche essere utilizzato in "saggi reporter massicciamente paralleli" per studiare i meccanismi di regolazione genica. Questo viene fatto trasfettando cellule di mammifero con una libreria di migliaia di plasmidi, ognuno contenente una variante mutata di un sito di regolazione genica "guidando" la trascrizione di una sequenza reporter che è accoppiata a tag unici. Dopo l'isolamento dell'RNA e il sequenziamento ad alto rendimento, i livelli di ciascun tag vengono valutati per valutare l'espressione del reporter da ciascun costrutto, che fornisce informazioni sull'importanza funzionale dei nucleotidi mutati in ciascuna variante del sito regolatorio.

Infine, il sequenziamento dell'RNA può essere adattato per studiare le interazioni RNA-proteina, in particolare per identificare i trascritti a cui una proteina di interesse si lega. La proteina è immunoprecipita con anticorpi e gli RNA legati sono definiti dal sequenziamento. Se i complessi RNA-proteina sono reticolati all'inizio, l'analisi di sequenziamento può mappare il sito del reticolo e identificare il sito di legame proteico sull'RNA fino al livello nucleotidico.

Hai appena visto il video di JoVE su RNA-seq. In questo video, abbiamo visto come i campioni di RNA vengono convertiti in librerie, sequenziati e i dati risultanti analizzati, nonché i tipi di informazioni che l'analisi di sequenziamento può fornire. Grazie alla sua sensibilità, al potenziale per essere utilizzato in qualsiasi organismo e al costo ridotto del sequenziamento, l'RNA-seq viene sempre più utilizzato in più aree della ricerca genetica e fornirà informazioni su molte questioni relative alla funzione e allo sviluppo delle cellule. Grazie per l'attenzione!

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