Overview
Fonte: Pablo Sanchez Bosch2, Sean Corcoran2 e Katja Brückner1,2,3
1 Eli and Edythe Broad Center of Regeneration Medicine and Stem Cell Research
2 Dipartimento di Biologia Cellulare e Tissutale,
3 Istituto di ricerca cardiovascolare, Università della California San Francisco, San Francisco, CA, USA
Rapid Amplification of cDNA Ends (RACE) è una tecnica che permette l'amplificazione del cDNA a lunghezza intera dall'mRNA estendendosi all'estremità 3' o 5', anche senza previa conoscenza della sequenza (Frohman et al., 1988). A differenza della normale PCR, utilizza solo un primer PCR specifico e un secondo primer non specifico che si legherà indiscriminatamente alla maggior parte degli mRNA. A seconda che l'area da amplificare sia all'estremità 3' o 5' dell'mRNA, il secondo primer viene scelto per legare la coda polyA (estremità 3') o un linker sintetico aggiunto a tutti i trascritti (estremità 5'). Queste combinazioni di primer sono note per produrre PCR "unilaterale" o "ancorata" a causa dell'amplificazione PCR utilizzando la sequenza nota di un lato - 3' o 5' (Ohara et al., 1989). L'approccio consente la cattura di mRNA rari gene-specifici che altrimenti sarebbero difficili da rilevare, ad esempio a causa della loro espressione relativamente bassa o della sequenza completa sconosciuta (Frohman et al., 1988).
RACE viene avviato con una fase di trascrizione inversa (RT) per sintetizzare il DNA complementare a singolo filamento (cDNA) dall'mRNA. Questo è seguito da due PCR consecutive che amplificano i frammenti di cDNA da un gene di interesse. Per eseguire RACE, la sequenza del gene di interesse deve essere almeno parzialmente nota, in quanto è necessaria per progettare i primer gene-specifici (GSP; Frohman, 1994; Liu e Gorovsky, 1993). Poiché la seconda coppia di primer è un primer generico che si ricottura a tutti i trascritti presenti nel campione, la specificità delle reazioni PCR è ridotta. RACE viene quindi eseguito idealmente con due PCR nidificate per ridurre le possibilità di amplificare trascrizioni non specifiche (Figura 1). A seconda della direzione di amplificazione rispetto al GSP, la tecnica è classificata come 5' o 3' RACE (Figura 1).
3' RACE (Figura 1A) sfrutta la coda poli(A) presente negli mRNA come sito di legame generico per il primer non specifico. Questo semplifica la tecnica, in quanto si può sintetizzare il cDNA usando primer oligo (dT). I GSP si trovano nella regione 5' delle trascrizioni. Questa variante RACE permette il rilevamento di varianti di trascrizione e diversi 3' UMR (Scotto Lavino et al., 2007a). In 5' RACE (Figura 1B), i GSP si trovano nella regione 3' del gene. Per essere in grado di utilizzare un primer non specifico che si lega a tutti i trascritti, un adattatore che funge da sito di legame del primer generico è collegato alle estremità dell'RNA 5 '. Per collegare l'adattatore all'mRNA, è necessario rimuovere il cappuccio da 5' che protegge gli mRNA dalle esonucleasi e promuove la traduzione (Bird et al., 2016). Opposto a 3' RACE, 5' RACE aiuta a trovare varianti differenziali di giunzione 5' e UMR alternativi da 5' (Scotto Lavino et al., 2007b).
Qui eseguiremo 3' RACE per identificare e isolare diverse varianti di trascrizione utilizzando la nota sequenza 5' (Figura 2A) codificata dal gene Drosophila dSmad2 (Smox). dSmad2, una proteina Smad della mosca, è un importante trasduttore della segnalazione di Activin-β, una via della superfamiglia TGF-β. dSmad2 regola molteplici processi cellulari, come la proliferazione cellulare, l'apoptosi e la differenziazione (Upadhyay et al., 2017). Poiché i trascritti differenzialmente spliced di dSmad2 possono avere funzioni diverse nella mosca adulta, un primo passo nell'esplorazione di queste potenziali funzioni è valutare tutte le varianti di trascrizione di dSmad2 in questa fase dello sviluppo.
Procedure
1. Configurazione dell'esperimento per 3' RACE
- Progettare un primer specifico da 5' per un gene di interesse (gene specific primer 1, GSP-1). Deve essere altamente specifico, in quanto è l'unico primer che introduce specificità. Pertanto, sarebbe preferibile un primer relativamente lungo (lunghezza tipica intorno a 24 nucleotidi, Tm che va da 55-65 ° C).
- Progettare un secondo primer nidificato (GSP-2), ovvero il primer dovrebbe trovarsi a 3' di GSP-1. Questo passaggio è facoltativo, ma l'esecuzione di una seconda PCR con un primer nidificato aumenterà la resa e la specificità della PCR per il gene di interesse. I primer utilizzati per amplificare i cDNA dSmad2 sono elencati nella Tabella 2.
2. Sintesi del cDNA
- Estrarre l'RNA dai campioni, utilizzando un metodo di estrazione dell'RNA o un kit seguendo il protocollo del produttore. Trattare i campioni con DNasi per evitare l'amplificazione del DNA genomico. Nel nostro esempio, abbiamo estratto l'RNA da 10 mosche adulte intere.
- Misurare la concentrazione di RNA utilizzando uno spettrofotometro a microvolume e regolare con acqua priva di RNasi fino a un massimo di 100 ng/μl, se necessario.
- Preparare il cDNA in una reazione di trascrizione inversa (RT), utilizzando un kit consigliato per RACE. Preparare una miscela principale, con i seguenti reagenti per campione:
- 4 μl Buffer di trascrizione inversa (5x)
- 2 μl Oligo(dT)20 primer (un oligo costituito da 20 desossitimidine)
- 10 μl RNA (max. 1 μg)
- 3 μl ddH2O
- 1 μl di trascrittasi inversa
- TOTALE: 20 μl - Incubare la reazione per 90 minuti a 42ºC. Includere un controllo negativo omettendo la trascrittasi inversa.
- Inattivare la trascrittasi inversa incubando a 85ºC per 5 min.
- Al fine di diluire i livelli di DNA per una PCR efficiente, aggiungere un tampone TE da 80 μl per portare il volume totale a 100 μl.
3. Amplificazione di frammenti di cDNA
- Preparare la miscela PCR di amplificazione del primo turno utilizzando una Taq polimerasi ad alta fedeltà (HF):
- Tampone 4 μl 5x HF Taq polimerasi
- 0,4 μl di miscela dNTP (10 mM ciascuno)
- 1 μl di primer GSP1 (10 μM)
- 1 μl di primer Oligo(dT)20 (10 μM)
- Modello cDNA da 1 μl
- 0,2 μl HF Taq DNA polimerasi
- 12,4 μl ddH2O
- Totale: 20 μl - Eseguire la PCR utilizzando il programma PCR1 (Tabella 1). Includere un controllo negativo utilizzando come modello il prodotto RNA originale senza RT. Inoltre, può essere incluso un controllo "no primer".
- Opzionale: PCR nidificata per aumentare la specificità e la quantità di prodotti a cDNA. Diluire 1 μl dei prodotti PCR e controllo negativo 1:20 nel tampone TE. Usali come modello per le seconde reazioni PCR:
- Tampone 4 μl 5x HF Taq polimerasi
- 0,4 μl di miscela dNTP (10 mM ciascuno)
- 1 μl di primer GSP2 (10 μM)
- 1 μl Oligo(dT)20 primer (10 μM)
- Modello di prodotto PCR da 1 μl
- 0,2 μl HF Taq DNA polimerasi
- 12,4 μl ddH2O
- Totale: 20 μl - Eseguire la seconda PCR utilizzando il programma PCR2 (Tabella 1)
4. Isolamento di frammenti di cDNA
- Preparare un gel di agarose all'1-2% con tampone TAE, usando bromuro di etidio o una colorazione di DNA alternativa.
- Miscelare 5 μl di campione con 1 μl di 6x tampone di carico del gel.
- Caricare i campioni e la scala del DNA da 1kb come marcatore ed eseguire il gel a 120 V per circa 45 minuti o fino a quando il fronte del colorante è ~ 75% della strada lungo il gel. Assicurarsi che i campioni non si esauriscano dal gel.
- Controllare le bande di gel sotto una lampada UV. Per l'ulteriore lavorazione dei prodotti, utilizzare UV a bassa intensità, individuare le bande amplificate e tagliarle dal gel usando un bisturi.
- Purificare il DNA dal gel utilizzando un metodo come il congelamento o un kit.
- Conservare i frammenti di cDNA purificati a -20ºC o utilizzarli immediatamente per ulteriori applicazioni, come il sequenziamento o la clonazione.
Tipicamente, con nuovi mRNA è nota solo una parte della sua sequenza completa. Le sequenze nucleotidiche mancanti alle estremità dell'mRNA possono essere determinate utilizzando un metodo basato sulla PCR chiamato Rapid Amplification of cDNA Ends, o RACE.
Negli eucarioti, gli mRNA maturi hanno caratteristiche strutturali distintive ad entrambe le estremità. All'estremità a cinque primi, la maggior parte ha un residuo di guanosina metilato collegato all'mRNA tramite un legame trifosfato da cinque primi a cinque primi. Questo è anche noto come il cappuccio a cinque primi. All'estremità a tre primi, la maggior parte degli eucarioti ha una coda di 20-250 residui di adenilato, chiamata coda poli(A).
Ora, se la sequenza nucleotidica anche di un piccolo segmento è nota ovunque all'interno dell'mRNA, la sequenza fino alla sua estremità a tre primi può essere amplificata usando un primer gene-specifico e un primer oligo(dT) non specifico che si ricottura alla coda poli(A) all'estremità a tre primi. Questo sottoinsieme della tecnica RACE è chiamato RACE a tre primi e consente il rilevamento di varianti di trascrizione e diverse regioni non tradotte a tre primi, o UTRA.
La sequenza all'estremità a cinque numeri primi può essere amplificata in modo simile. Per fare questo, una coda poly(A) viene prima attaccata all'estremità a cinque primi. Quindi, utilizzando un primer oligo(dT) non specifico che si ricottura alla coda aggiunta e un primer gene-specifico, la sequenza fino all'estremità a cinque primi può essere amplificata. Questo sottoinsieme di RACE è noto come RACE a cinque primi e viene utilizzato per trovare varianti differenziali a cinque giunzioni a cinque primi e UMR alternativi a cinque primi.
Per eseguire la RACE a tre primi per identificare diversi trascritti codificati da un dato gene, l'RNA viene prima isolato dall'organismo o dal tessuto di interesse. Successivamente, il cDNA viene sintetizzato dagli mRNA isolati con una reazione di trascrizione inversa che utilizza un primer oligo (dT) e un enzima trascrittasi inversa, che genera DNA complementare da un modello di RNA. Successivamente, dal pool generato di cDNA, l'estremità a tre primi sconosciuta del cDNA bersaglio viene estesa tramite PCR, utilizzando il primer oligo (dT) non specifico e un primer gene-specifico, e amplificata durante la reazione PCR.
Tuttavia, a causa della natura generica del primer non specifico e del mispriming casuale da parte del primer gene-specifico, possono ricottura a cDNA fuori bersaglio, causandone anche l'amplificazione. Per superare questo problema, un secondo ciclo di PCR viene condotto utilizzando primer nidificati, che si legano a valle del primo set di primer. Questa seconda serie di primer amplifica ulteriormente il cDNA di interesse ma non il prodotto non specifico, aumentando la specificità e la resa della reazione.
Infine, i prodotti PCR vengono separati mediante elettroforesi su gel di agarose, che separa diversi trascritti del gene bersaglio in base alle loro dimensioni, producendo bande distinte. La banda di interesse può quindi essere asportata, purificata e infine sequenziata per ottenere la sequenza completa della trascrizione.
In questo video, dimostreremo la tecnica RACE a tre primi per identificare e isolare diversi trascritti codificati dal gene Drosophila dSmad2.
Prima di iniziare la sintesi e l'amplificazione del cDNA, utilizzare un software di progettazione del primer per creare un primer specifico a cinque numeri primi per il gene di interesse, dSmad2 in questo esempio. Per garantire che il primer sia altamente specifico, dovrebbe essere di circa 24 nucleotidi e avere una Tm che va da 55 a 65 gradi Celsius. Quindi, progettare un secondo primer nidificato situato a tre primi del primo primer, che è anche specifico per la sequenza di destinazione.
Per iniziare, estrai l'RNA da 10 mosche adulte intere con un kit di estrazione dell'RNA disponibile in commercio. Una volta estratto l'RNA, risuscie il pellet in 20 microlitri di acqua priva di nucleasi. Per una reazione a 50 microlitri, aggiungere 5 microlitri del tampone di reazione a ciascuna provetta campione e aumentare il volume della reazione aggiungendo 24 microlitri di acqua priva di nucleasi. Quindi, aggiungere 1 microlitro di DNasi I per prevenire l'amplificazione del DNA genomico. Infine, incubare i campioni a 37 gradi Celsius per 15 minuti.
Dopo il trattamento con DNasi, inattivare l'enzima con 1 microlitro di EDTA millimolare 25 millimolare in ciascuno dei tubi. Aggiungere il campione a una colonna di spin per purificare l'RNA. Quindi, utilizzare uno spettrofotometro a microvolume per misurare la concentrazione di RNA. Regolare la concentrazione a 100 nanogrammi per microlitro aggiungendo acqua priva di nucleasi.
Ora, prepara un mix principale per la reazione di trascrizione inversa. Oltre ai campioni di DNA del test, includere un controllo negativo omettendo la trascrittasi inversa dalla provetta appropriata. Incubare le reazioni per 90 minuti a 42 gradi Celsius. Quindi, inattivare la trascrittasi inversa incubando i tubi a 85 gradi Celsius per cinque minuti. Quindi, diluire i livelli di DNA aggiungendo 80 microlitri di tampone TE a ciascun tubo per portare il totale della reazione a 100 microlitri.
Ora che il cDNA è sintetizzato, amplificare il gene di interesse tramite PCR. Per fare questo, preparare prima il primo round amplificazione PCR mix. Oltre al modello cDNA, includere una reazione di controllo negativa che utilizza il modello dal prodotto non trascritto inverso, nonché una reazione che non ha il primer gene-specifico come controllo senza primer.
Una volta preparate le reazioni, effettuare le amplificazioni PCR in un termociclatore dotato di coperchio riscaldato. Quindi, diluire i prodotti da 1 a 20 aggiungendo 1 microlitro dei prodotti PCR a 19 microlitri di tampone TE. Utilizzando questi prodotti diluiti, preparare la miscela PCR di amplificazione del secondo round. Quindi, utilizzare un termociclatore per eseguire la seconda PCR.
Per isolare i frammenti di PCR, preparare un gel di acarosio all'1% aggiungendo 1 grammo di agarose per 100 millilitri di tampone TAE. Sciogliere la miscela per due minuti nel microonde, quindi aggiungere la macchia SYBR Safe o il bromuro di etidio. Versare la miscela fusa in un vassoio di gel e lasciarla riposare.
Mentre il gel sta impostando, pipettare 1 microlitro goccioline di 6X Loading Dye su un pezzo di parafilm corrispondente al numero di campioni. Aggiungere 5 microlitri di campione a ciascuna goccia. Ora, carica i campioni, insieme a una scala di DNA da 1 kilobase, sul gel. Eseguire il gel a 120 volt per circa 45 minuti o fino a quando la parte anteriore del colorante è al 75% della discesa del gel.
Quando il gel ha finito di funzionare, controllare le bande di gel sotto un transilluminatore UV. Individua le fasce e ritagliali usando un bisturi. Purificare i frammenti di cDNA utilizzando un kit di colonne di spin disponibile in commercio. Una volta purificati, i frammenti di cDNA possono essere conservati a meno 20 gradi Celsius o utilizzati immediatamente per ulteriori analisi.
Prima di questo esperimento, due trascrizioni per Drosophila dSmad2 sono state annotate nel database genomico di Drosophila, FlyBase. Sulla base dello splicing previsto di questo gene, due prodotti dovrebbero essere identificati dal protocollo RACE a tre primi.
I risultati di questo esperimento, tuttavia, rivelano tre diverse trascrizioni per dSmad2. Tra i prodotti previsti, una trascrizione è predominante e una è espressa a un livello inferiore. Inoltre, è stato rilevato un prodotto più piccolo precedentemente non descritto, visibile a 750 paia di basi.
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Results
Ci sono due trascrizioni annotate per Drosophila dSmad2 in FlyBase (Fig. 2A). I nostri risultati, tuttavia, rivelano tre diverse trascrizioni per dSmad2, di dimensioni variabili da 750 bp a 1400 bp (Fig. 2B). Le differenze nell'intensità delle bande indicano i loro livelli di espressione relativa. Tra i prodotti previsti, una trascrizione è predominante (Fig. 2B, freccia nera A) e una è espressa a un livello inferiore (Fig. 2B, freccia nera B). Inoltre, è stato rilevato un prodotto più piccolo precedentemente non descritto (Fig. 2B, freccia grigia C).
L'identificazione di trascrizioni così rare è possibile solo con un metodo sensibile come RACE. Seguendo RACE, si possono clonare i frammenti ottenuti dalla PCR per studiare la sequenza di trascrizione, trovare la sua somiglianza con altre varianti di trascrizione e clonarla per la transgenesi. Tali esperimenti aiutano a studiare le funzioni delle varianti di trascrizione specifiche per un tessuto o uno stadio di sviluppo.
Figura 1. Schemi dei due diversi approcci RACE. A) 3' GARA. Il cDNA viene sintetizzato utilizzando primer oligo (dT). Lo stesso primer oligo (dT) viene utilizzato in combinazione con un primer gene-specifico da 5' per amplificare le estremità del cDNA 3' attraverso uno, o meglio due, cicli di PCR. B) 5' GARA. L'RNA viene prima decapped per liberare l'estremità 5'. In una seconda fase, una sequenza di RNA adattatore viene aggiunta all'estremità 5'. Il cDNA viene generato utilizzando un primer complementare alla sequenza dell'adattatore. Lo stesso primer viene utilizzato in combinazione con primer/i gene-specifico da 3' per amplificare il cDNA.
Figura 2. A) RACE permette l'amplificazione di più trascrizioni dello stesso gene, esemplificate da 3' RACE di Drosophila dSmad2. La combinazione di un primer non specifico (Oligo dT) con un primer gene-specifico (GSP) produce cDNA di diverse lunghezze (Prodotto A, Prodotto B) corrispondenti a trascritti alternativamente giuntati (mRNA A, mRNA B). B) Separazione dei prodotti PCR di dSmad2 3' RACE su un gel di agarose all'1%. Le corsie corrispondono a (1) scala del DNA da 1 kb come marcatore, (2) nessun controllo negativo RT (contiene RNA e primer), (3) nessun controllo negativo dei primer (contiene il modello di cDNA) (4) reazione completa di 3' RACE per dSmad2 (contiene. primer e modello cDNA). L'amplificazione delle trascrizioni di dSmad2 da parte di 3' RACE produce tre prodotti distinti (frecce). Due cDNA erano di dimensioni previste intorno a 1400 e 1200bp (frecce nere A e B, corrispondenti al prodotto A e B in (A)). Inoltre, è stato rilevato un cDNA più piccolo precedentemente non descritto di ~ 750bp (freccia grigia, C).
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Applications and Summary
RACE fornisce uno strumento rapido, economico e potente per ottenere cDNA da sequenze che sono solo parzialmente conosciute o da trascrizioni rare che altrimenti sono più difficili da amplificare. Può essere utilizzato per trovare la sequenza di trascrizioni sconosciute da un gene già noto o per clonare tali trascrizioni per ulteriori studi. Seguendo RACE, tali trascrizioni possono essere sovraespresse in sistemi cellulari o organismi modello per studiare la loro funzione in vivo.
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Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni della National Science Foundation # IOS-1355222 e del National Institutes of Health # 1R01GM112083 e 1R01GM131094 (a K.B.).
References
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- Frohman, M.A. (1994). On beyond classic RACE (rapid amplification of cDNA ends). PCR Methods Appl. 4, S40–S58.
- Frohman, M.A., Dush, M.K., and Martin, G.R. (1988). Rapid production of full-length cDNAs from rare transcripts: amplification using a single gene-specific oligonucleotide primer. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.a. 85, 8998–9002.
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