用放射性标记的ATP测定蛋白激酶活性

该测定的总体目标是测量蛋白激酶的酶活性。该方法可以帮助回答激酶信号转导领域的关键问题，例如激酶或激酶突变体的活性、特异性以及其活性是否对不同的细胞处理敏感。这种技术的主要优点是它既通用又定量。

科布实验室的研究科学家史蒂夫·斯蒂佩克 （Steve Stippec） 将演示该程序，他在这种检测方面拥有丰富的经验。首先，在 200 μL 细胞裂解物中加入 2 μL（每毫升 1 毫克）抗体，并在 4 摄氏度下摇动孵育 1 小时。通过添加裂解缓冲液洗涤蛋白 A-Sepharose 珠子 2 到 3 次，然后在 4 摄氏度下以 5000 次 g 的浓度触摸旋转 30 秒至 1 分钟，然后用移液管去除上清液，并将珠子重新悬浮在缓冲液中。

接下来，向裂解物中加入 30 微升 50% 蛋白 A-琼脂糖珠浆液和裂解缓冲液。将裂解物在 4 摄氏度下孵育 1 小时，同时摇动。在 4 摄氏度下触摸旋转以沉淀珠子并去除上清液。

用 1 毫升磁珠洗涤缓冲液洗涤磁珠 3 次，然后触摸旋转，然后用 1 个 X 激酶反应缓冲液洗涤磁珠 1 次。触摸旋转后，在不去除珠子的情况下去除尽可能多的缓冲液。为了初始化检测，将整个反应混合物添加到激酶样品中。

将反应在 30 摄氏度下孵育 5 分钟至 1 小时，具体取决于所检测激酶的活性。将反应置于冰上并加入 7.5 μL 5 X Laemmli 样品缓冲液，然后在加热块中以 100 摄氏度加热反应 3 至 5 分钟，以终止反应。触摸离心样品后，在 10 至 15%SDS-PAGE 凝胶上每孔加载 20 μL。

确保保持凝胶装置的屏蔽状态，以限制接触磷 32，因为它是一种高能 β 发射体。运行凝胶足够长的时间以分离激酶和底物。电泳后，从玻璃板和铝板中取出凝胶，然后将凝胶置于 50 毫升考马斯染色剂中，在设置为 50 RPM 的轨道摇床上放置 1 小时。

对于此步骤，请使用比凝胶本身略大的容器。要使凝胶脱色，请将其从染色剂移至固定液中。将泡沫片或打结的实验室湿巾放入装有凝胶的容器中，以吸收考马斯染料。

凝胶放入 600 至 700 mL 固定液中，在轨道摇床上以 50 RPM 的速度摇动过夜。第二天，从固定液中取出凝胶，将其浸泡在 200 毫升甲醇中 1 到 2 分钟，轻轻搅拌，直到凝胶变成乳白色。这将有助于防止在干燥步骤中开裂。

接下来，用甲醇润湿一张大约 14 厘米 x 14 厘米的定性滤纸，然后将其放在平板凝胶真空干燥器上。将凝胶放在滤纸上，正面朝上。小心地用保鲜膜覆盖凝胶，然后打开并运行烘干机并施加真空。

几秒钟后达到真空后，用柔软的橡胶布雷器滚出气泡。继续运行 90 分钟。取出干燥的凝胶，将 autorad 标记物（例如磷光尺或点）贴在凝胶侧面的滤纸上，然后将其放入含有增强屏幕的盒中。

使用 Geiger 计数器检查信号的强度。对于较弱的信号，在零下 70 摄氏度到零下 80 摄氏度的曝光下使用增强屏幕会增加胶片带密度。在暗室中，将一块胶片放在包含增强屏幕的胶片盒内的干燥凝胶顶部。

如果 CPM 计数为 100 或更低，请尝试在零下 70 到 80 摄氏度下过夜曝光。或者，如果计数接近 10， 000，则从 1 小时的曝光开始，然后从那里进行优化。曝光结束时，请先去除胶片，然后再在医用或 X 射线胶片冲洗机中显影。

在胶片上标记与蛋白质标准品相对应的条带。此外，标记蛋白质标准品和反应泳道以备将来参考。从凝胶中切除与胶片上感兴趣的条带相对应的条带。

将条带放入 7 毫升闪烁瓶中，并加入 4 毫升闪烁液。用液体闪烁计数器计算波段。确认计数器设置为监视磷 32 的正确能谱窗口。

继续按照文本协议中的说明分析结果。在存在或不存在 MEK1R4F 的情况下，将纯化的 ERK2 组分用于 MBP 激酶测定， 是 ERK2 激酶活性的组成型活性刺激物。在类似的实验中，使用 MBP 激酶测定法测量从细菌培养物中纯化的重组 ERK2 突变体相对于野生型蛋白的活性。

尽管 ERK2 在受到 MEK1R4F 刺激时能够磷酸化 MBP，但 ERK2 激酶活性会因催化赖氨酸或双磷酸化经典位点近端的苏氨酸突变而显著失效。ERK2 T188D 和 ERK2 T188E 对小的柔性肽显示出边缘激酶活性。然而，它们无法稳健地磷酸化已知的 ERK2 底物 Nup153 和 PDX1，如野生型 ERK2 所示。

一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在一到两天内完成。观看本视频后，您应该对如何使用放射性标记的 ATP 检测蛋白激酶的活性有很好的了解，以更好地了解它们所在的信号转导网络。在尝试此过程时，请务必记住优化氨基沉淀方案，以提取感兴趣的激酶，以解释相等的蛋白质量，并测量重组蛋白的浓度，以确保激酶活性的准确比较。

开发后，该技术为细胞信号转导领域的研究人员探索特定的转导途径及其在稳态调节中的作用以及它们对疾病进展的贡献铺平了道路。不要忘记，使用放射性材料可能非常危险，因此在执行此程序时应始终采取预防措施，例如佩戴个人防护设备。