过表达蛋白激酶C同工酶的肾细胞中线粒体功能与细胞活力的评估

本实验通过选择性调控蛋白激酶C同工型，以确定其在不同生理和病理条件下对肾近端小管细胞中线粒体及细胞功能的影响。首先，从肾皮质中分离原代肾近端小管细胞，或获取具有氧化代谢特性的肾近端小管细胞，其代谢特征与肾近端小管相似。

使用表达蛋白激酶C活性形式和非活性形式的腺病毒载体在体内感染RPC细胞，然后检测不同的线粒体功能和细胞活力，以确定该同工酶对线粒体合成ATP能力及抑制细胞死亡的作用。同时对收集的细胞裂解液进行磷酸化蛋白激酶C epsilon的免疫印迹分析。

结果表明，蛋白激酶ε的激活会负向调控线粒体生成ATP的能力，降低细胞内ATP水平以及肾近端小管上皮细胞的存活率。与现有的细胞系等技术相比，该方法的主要优势在于，肾近端小管上皮细胞的原代培养能够维持肾近端小管的分化功能和氧化代谢特性。由于蛋白激酶可作为靶点及潜在的治疗剂，该技术的应用前景可延伸至治疗领域，用于预防肾脏损伤或促进损伤后肾脏的修复。

该方法可深入了解损伤与修复的机制。此外，该方法还可应用于新鲜分离的兔肾，依次用50毫升无菌D-M-E-M-F 12培养基、无菌磷酸盐缓冲液（pH 7.4）和PBS铁氧化物溶液灌注，以获取每个肾脏的皮质组织。

首先使用15毫升下冲式匀浆器对组织进行匀浆。然后将匀浆液通过两个无菌网筛过滤至一个1升无菌烧杯中。用含有去铁胺的缓冲液冲洗残留在筛网上的细胞。

将残留于底部的任何组织转移至含有去铁胺的缓冲液中，该缓冲液为40毫升，置于锥形离心管内。用强磁铁轻轻混合细胞悬液。

捕获含铁的肾小球，并吸除附着在磁铁上的铁颗粒。将细胞悬液的体积调整至40毫升，加入1毫升含有胶原酶的消化液。在室温下孵育17分钟。

轻轻混匀悬浮液。在多次洗涤后，于4°C条件下以50 × g离心2分钟收集细胞。将细胞沉淀重悬于46毫升不含葡萄糖的培养基中。

将原代肾小管上皮细胞（RPTCs）以每皿1 mg蛋白密度接种于2 mL无葡萄糖的D-M-E-M-F12培养基中，在37°C、5%二氧化碳条件下置于旋转摇床上培养。更换培养基后，用携带编码组成型激活蛋白激酶Cε或显性失活蛋白激酶Cε的cDNA的腺病毒转染汇合的RPT细胞，孵育24小时，随后更换培养基，并继续培养转染后的原代RPTCs 24小时。为观察原代细胞单层的线粒体形态，更换培养基后加入MitoTracker Red 580，将培养皿放回培养箱孵育30分钟。

然后使用水浸物镜在荧光显微镜下观察活细胞单层。目标二：通过配备克拉克型电极的氧消耗室，评估肾近端小管上皮细胞（RPTC）悬液的三态呼吸，以评价线粒体功能。

首先，在无解偶联剂（DP）的条件下测定状态二呼吸。然后加入解偶联剂（DP），使其终浓度为0.4毫摩尔。为启动状态三呼吸，进行状态四呼吸测定。加入寡霉素，使其终浓度为0.5微克/毫升。

通过向处于状态三呼吸的细胞中加入 0.5 微摩尔 FCCP，同时测定解偶联呼吸的数值。向每皿 RPTC 培养物中缓慢加入 20 微升 0.5 毫摩尔 JC-1 溶液，并轻轻摇晃以充分混匀染料。将培养皿放回培养箱中孵育 30 分钟。

接下来，将培养物置于冰上，并用预冷的 PBS 洗涤两次。然后收集细胞。将 RPT 细胞转移至离心管中，通过吹打将单层细胞分散成单细胞悬液。

使用488纳米氩离子激光激发，通过流式细胞术分析荧光。然后计算分离线粒体的线粒体膜电位。以评估呼吸链完整性的检测。

用预冷的 PBS 缓冲液洗涤 RPTC 单层细胞两次后，收集细胞并通过离心形成沉淀。将沉淀用一毫升缓冲液 A 洗涤一次，然后在 Dounce 匀浆器中匀浆细胞，直至在显微镜下观察发现匀浆液中大多数细胞已破裂。接下来，通过低速离心去除细胞碎片。

在4°C条件下，以15,000 × g离心10分钟，从上清液中沉淀粗线粒体，并用缓冲液c对沉淀的线粒体进行三次洗涤。将线粒体沉淀重悬于50至100微升的测定缓冲液中，用液氮速冻，用于测定NADH泛醌氧化还原酶活性。在500微升含有添加物的测定缓冲液中加入线粒体，同时设置一个空白样品，包含所有添加物但不加线粒体。将反应体系在30°C下振荡平衡5分钟。

接下来，将酶标板放入分光光度计中，并向每个孔加入 10 µL 的 3.25 mmol/L 泛醌以启动反应。以 22 秒为间隔，记录 3 分钟内 340 nm 处的吸光度变化。在类似的测定中，使用还原型细胞色素 C 作为底物，测定细胞色素 C 氧化酶的活性，用于 ATP 合酶反应。

为测定各处理组的总酸性磷酸酶（APAs）活性和寡霉素不敏感的APAs活性，配制相应的反应混合液。将样品加入反应混合液中，在31摄氏度下孵育10分钟。加入TP底物启动反应，并在31摄氏度下继续孵育5分钟。

将200微升孵育混合物转移至含有50微升3摩尔TCA的离心管中，冰上孵育10分钟以沉淀蛋白质，随后离心收集沉淀。然后在96孔板中每孔加入50微升磷酸盐标准品和50微升各样品上清液，每个样品设两个复孔。

然后向每个孔中加入 250 µL 的萨姆纳试剂，在 30 °C 下孵育 15 分钟。随后在 595 nm 处测定吸光度。用预冷的 PBS 缓冲液将 RPTC 单层细胞洗涤两次。

用1毫升PBS收集细胞，并将细胞悬液转移至离心管中。通过离心沉淀RPTC样品，并使用ATP生物发光检测试剂盒的荧光素酶法测定总蛋白（TP）含量。对于35毫米培养皿中的细胞活力分析，每组使用五个RPTC单层细胞，包括三个对照处理组：分别为坏死细胞阳性组、凋亡细胞阳性组以及无染色对照组，每组设两个培养皿。

向第二组加入 2 µL 的 50 毫摩尔顺铂。加入 2 µL 的 500 毫摩尔叔丁基过氧化氢。按照随附文本中所述使用碘化丙啶对细胞进行染色后，用结合缓冲液洗涤单层细胞。

接下来，按照文本方案中的说明，使用与 ZI 偶联的 ANNEXIN five 对细胞进行染色。然后轻轻收集细胞，并将其重悬于 500 微升结合缓冲液中。使用橡胶刮棒。

使用移液器将细胞分散成单细胞悬液，并将细胞悬液转移至流式细胞术检测管中。将细胞充分分散为单细胞悬液。立即进行流式细胞术检测PI和FE的荧光强度。通过腺病毒递送CD NA包被的蛋白激酶C epsilon的组成型活性突变体和非活性突变体，可显著提高肾小管上皮细胞（RPTC）及线粒体中蛋白激酶C epsilon的蛋白水平。

正如预期，该酶的组成型活性形式在肾小管上皮细胞（RPTC）中发生磷酸化，而显性失活酶则未被磷酸化。无论采用何种底物为线粒体提供能量，活性蛋白激酶C epsilon均会降低RPTC的线粒体呼吸；但失活的蛋白激酶C epsilon对线粒体呼吸无任何影响。

有趣的是，蛋白激酶C epsilon在肾小管上皮细胞（RP TCS）中的激活会降低复合物I和复合物IV的活性。肾小管上皮细胞呼吸作用的这种降低与线粒体膜电位的升高相关。而显性负性突变体则无此效应。

这些变化还伴随着从过表达活性蛋白激酶 C epsilon 的肾近端小管上皮细胞（RPTC）中分离出的线粒体内 TP 合酶活性的降低。结果，过表达活性蛋白激酶 C epsilon 的 RPTC 中 ATP 含量减少。蛋白激酶 C epsilon 的持续激活对线粒体形态产生显著影响，表现为线粒体断裂。

蛋白激酶C的激活而非抑制，也会导致RPTC形态改变，引起细胞皱缩以及存活细胞的伸长。在RPCs中过表达活性蛋白激酶C epsilon所引起的线粒体效应，也与坏死性细胞死亡和凋亡性细胞死亡相关。

观看本视频后，您应能够充分理解如何利用腺病毒技术在原代培养细胞中过表达蛋白，以及如何评估线粒体的三磷酸腺苷（ATP）合成能力。一旦掌握，若操作得当，该技术可在四小时内完成。此外，请务必注意，腺病毒具有潜在生物安全风险，因此应采取适当的防护措施。