评估肾细胞​​蛋白激酶C同工酶，线粒体功能及细胞活力的

活化的蛋白激酶C（PKC）的同工酶与呼吸，氧化磷酸化有关的线粒体功能和对细胞活力的影响进行说明。该方法适应腺病毒技术，选择性过度表达PKC同工酶在原代培养和各种检测，以确定线粒体功能和能量状态的细胞。

本实验利用蛋白激酶 C ISO xms 的选择性调节来确定它们在各种生理和病理条件下肾近端肾小管细胞中的线粒体和细胞功能。首先，从具有氧化代谢的肾皮层或 RPC 中分离原代肾近端肾小管细胞。类似于肾近端小管的体型。

Vivo 用腺病毒载体感染 RPC，这些载体表达蛋白质 isys 的活性和非活性形式。然后，激酶 C 检测不同的线粒体功能和细胞活力，以确定 is 酶对线粒体合成 A TP 和防止细胞死亡能力的影响。还可以对一起提取的细胞裂解物中的磷酸化和蛋白激酶 C ε 进行免疫印迹分析。

结果表明，蛋白激酶 ε 的激活负向调节线粒体产生 A TP 的能力，降低 TP 的细胞水平和肾近端肾小管细胞的活力。我们现有技术（例如细胞系）的这种技术的主要优点是肾近端肾小管细胞的原代培养物维持了肾近端肾小管细胞的分化功能并氧化了 ME。由于蛋白激酶可用作靶标和潜在的治疗剂，因此该技术的意义延伸到治疗、预防肾损伤或加速损伤后的肾脏恢复。

该方法可洞察损伤和恢复机制。它也可以依次应用于 50 毫升的新鲜分离的兔肾。每个无菌 D-M-E-M-F 12 培养基无菌磷酸盐缓冲盐水，pH 7.4 和 PBS 氧化铁溶液，以收获每个肾脏的皮层。

首先使用 15 毫升羽绒匀浆器匀浆组织。然后将匀浆通过两个无菌网筛放入 1 升无菌烧杯中。用含有去铁胺的缓冲液冲洗筛子上残留的细胞。

转移底部残留的任何组织。将 85 微米筛子放入 40 毫升含去铁胺的缓冲液中，置于锥形离心管中。将细胞悬液与强磁铁轻轻混合。

捕获充满铁的肾小球并吸出附着在磁体上的铁。将细胞悬液的体积调节至 40 毫升，并加入 1 毫升含有胶原酶的消化培养基。在室温下孵育 17 分钟。

轻轻混合悬浮液。洗涤数次后，在 4 摄氏度下以 50 倍 G 离心 2 分钟，收获细胞。Resus 将细胞沉淀悬浮在 46 毫升不含葡萄糖种子的培养基中。

密度为每皿 1 毫克蛋白质的初级 RT PC 置于 37 摄氏度和 5% 二氧化碳的轨道振荡器上，在 2 毫升无葡萄糖的 D-M-E-M-F 12 培养基中培养。补充培养基后，继续用携带组成型活性蛋白激酶 C ε 或显性阴性蛋白激酶 C ε 的 CD NA 腺病毒感染汇合的 RPT 细胞，孵育 24 小时，补充培养基并培养转染的原代 RPC 再培养 24 小时。为了观察原代细胞单层的线粒体形态，补充培养基，添加 MIT 追踪器红色五 80，然后将培养皿放回培养箱中 30 分钟。

然后使用水浸在荧光显微镜下检查活的单层。目标二.为了评估线粒体功能，在配备有 Clark 型电极的耗氧室中评估 RPTC 悬浮液的状态 3 呼吸。

首先测量在没有 DP 的情况下进行 2 次呼吸。然后加入 DP 至终浓度为 0.4 毫摩尔。启动状态 3 呼吸 对于状态 4 呼吸。添加寡核苷酸霉素至终浓度为 0.5 μg/mL。

还包括通过向处于状态 3 呼吸的细胞添加 0.5 微摩尔 FCCP 来测量非耦合呼吸。向每个 RPTC 培养皿中缓慢加入 20 微升 0.5 毫摩尔 JC 一种溶液，并旋转以彻底混合染料。将培养皿放回培养箱中 30 分钟。

接下来，将培养物放在冰上并进行两次冰冷的 PBS 洗涤。然后收获细胞。将 RPT 细胞转移到 einor 管中，并通过移液将单层分解成单细胞悬液。

使用 488 纳米氩离子激光器激发，通过流式细胞术分析荧光。然后计算线粒体膜电位分离的线粒体。促进对呼吸链完整性的评估。

用冰冷的 PBS 缓冲液洗涤 RPTC 单层两次后，收获细胞并通过离心沉淀。在一毫升缓冲液 A 中洗涤沉淀一次，然后在羽绒匀浆器中匀浆细胞，直到在显微镜下检查时匀浆中的大部分细胞破裂。接下来，通过低速离心去除细胞碎片。

清液中的粗线粒体在 4 摄氏度下以 15， 000 倍 G 沉淀 10 分钟，并在缓冲液 c 中对沉淀的线粒体进行 3 次洗涤，将线粒体沉淀重悬于 50 至 100 微升测定缓冲液中，并在液氮中冷冻以测定 NADH 泛醌氧化还原酶活性。添加 500 微升检测缓冲液，线粒体还包括一个空白样品，该样品具有所有添加物但没有线粒体。在 30 摄氏度下平衡板，混合 5 分钟。

接下来，将板放入规格中，加入 10 微升 3.25 毫摩尔泛醌，在每个容器中开始反应。以 22 次间隔记录 340 纳米处的吸光度 3 分钟。在类似的测定中，使用还原的细胞色素 C 作为 A TP 合酶反应的底物来测量细胞色素 C 氧化酶的活性。

准备混合物，用于测定每个治疗组的总 APAs 活性和寡霉素不敏感的 APAs 活性。将样品在 31 °C 的反应混合物中孵育 10 分钟。加入 TP 底物开始反应，并在 31 摄氏度下孵育 5 分钟。

将 200 μL 孵育混合物转移到含有 50 μL 三摩尔 TCA 的试管中，将蛋白质在冰上沉淀 10 分钟。然后离心沉淀。接下来，将 50 微升磷酸盐标准液和 50 微升每种样品上清液一式两份加载到 96 孔板中。

然后向每个孔中加入 250 μL Sumner 试剂，在 30 摄氏度下孵育 15 分钟。然后记录 595 纳米处的吸光度。用冰冷的 PBS 缓冲液洗涤 RPTC 单层两次。

在 1 毫升 PBS 中收获细胞，并将细胞悬液转移到 einor 管中。通过离心沉淀 RPTC 样品，并使用 A TP 生物发光测定试剂盒的荧光素酶方法测定 TP 含量。为了分析 35 毫米培养皿中的细胞活力，对 3 个 OSIS 细胞阳性细胞的 3 个对照处理组使用 5 个 RPTC 单层，对 2 个培养皿使用无染色对照。

在第二组中加入 2 微升 50 毫摩尔顺铂。加入 2 微升 500 毫摩尔 turt 丁基氢过氧化物。如随附文本中所述，使用碘化丙啶对细胞进行染色后，用结合缓冲液洗涤单层细胞。

接下来，使用与 ZI 偶联的 ANNEXIN five 对细胞进行染色，如文本方案中所述。然后轻轻收获细胞并将它们悬浮在 500 μL 的结合缓冲液中。使用橡胶警察。

使用移液器将细胞分散到单个细胞悬液中，并将细胞悬液转移到流式细胞仪管中。将细胞分散到单个细胞悬液中。立即通过流式细胞术定量 PI 和 FE 的荧光，腺病毒递送 CD NA 包被蛋白激酶 C ε 的组成活性和非活性突变体，导致 RPTC 和线粒体中蛋白激酶 C ε 的蛋白水平显着增加。

正如预期的那样，酶的组成型活性形式在 RP tcs 中被磷酸化，而显性负酶未被磷酸化。活性蛋白激酶 C ε 的存在会降低 RPTC 中的线粒体呼吸，无论用于为线粒体提供能量的底物是什么。但失活的蛋白激酶 C ε 对线粒体呼吸没有影响。

有趣的是，RP TCS 中蛋白激酶 C ε 的激活降低了四分之一的复合物活性。RPTC 呼吸的这种减少与线粒体膜电位的增加有关。显性负突变体没有这种效果。

这些变化还伴随着从 RPTC 分离的线粒体中 TP 合酶活性的降低，而不是表达活性蛋白激酶 C ε。因此，RPTC 的 A TP 含量超过表达活性蛋白激酶 C ε 会降低蛋白激酶的持续激活。C ε 对线粒体形态有深远的影响，线粒体碎裂证明了这一点。

蛋白激酶 C 激活，但不是抑制。还导致 RPTC 形态的变化，导致存活细胞的细胞收缩和伸长。在 RPC 中过表达活性蛋白激酶 C ε 的这些线粒体效应也与 ons 和 appitosis的细胞死亡相关。

观看本视频后，您应该对如何使用腺病毒技术在原代培养物中过表达蛋白质以及如何评估线粒体合成 TP 的能力有很好的了解。一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在四个小时内完成。而不足的是，不要忘记与腺病毒一起工作，因此请采取适当的预防措施。