Name: 评估肾细胞蛋白激酶C同工酶，线粒体功能及细胞活力的 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-07T12:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 43 s
Description: 了解蛋白激酶C同工酶调控肾近端小管细胞线粒体功能与细胞活力的方法。该技术利用腺病毒载体选择性调节PKC同工酶活性，评估其对线粒体呼吸、ATP合成及细胞存活的影响，为肾脏疾病治疗提供潜在靶点。

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本研究工作获得了美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）下属的国家糖尿病、消化系统与肾脏疾病研究所（National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases）的资助项目2R01DK59558（资助对象：G.N.）。美国国立卫生研究院研究资源中心（National Center for Research Resources）通过资助项目UL1 RR029884支持了阿肯色医科大学（UAMS）转化研究研究所（Translational Research Institute），该资助为UAMS流式细胞术核心实验室（Flow Cytometry Core）提供了部分经费支持。我们感谢加州大学洛杉矶分校（University of California at Los Angeles；加利福尼亚州洛杉矶市）的Peipei Ping博士提供了携带编码PKC-ε显性负性（失活）突变体cDNA的腺病毒等分试样，同时感谢洛约拉大学医学中心（Loyola University Medical Center；伊利诺伊州梅伍德市）的Allen Samarel博士提供了编码PKC-ε组成型活性突变体的腺病毒载体等分试样。此外，我们还感谢伦敦帝国理工学院（Imperial College London，英国伦敦）的Peter Parker博士和Peter Sugden博士提供了编码组成型活性PKC-ε的cDNA。

1. 肾近端小管的分离以进行原代培养
<ol>
	<li>麻醉兔子，切除双侧肾脏，并将其置于超净工作台中装有无菌预处理缓冲液（DMEM/F12 培养基）的培养皿内。</li>
	<li>用 50 ml 预处理缓冲液灌注每侧肾脏，随后依次使用 50 ml 无菌磷酸盐缓冲液（pH 7.4，PBS）和 PBS-氧化铁溶液（45 ml + 5 ml）进行灌注。去除肾包膜后，将肾脏转移至含去铁胺的预处理缓冲液中。</li>
	<li>分离并收集每侧肾脏的皮质组织。</li>
	<li>使用 15 ml 玻璃匀浆器匀浆组织。将匀浆液倒入置于 1 L 无菌烧杯上的两层无菌筛网（底部为 85 μm，顶部为 235 μm）中过滤。用含去铁胺的缓冲液冲洗筛网。</li>
	<li>将残留在 85 μm 筛网上的组织收集至装有 35–40 ml 含去铁胺缓冲液的无菌锥形离心管中。轻柔混悬细胞悬液。</li>
	<li>将强磁铁置于管外以去除含铁的肾小球，静置使悬液沉降。使用巴斯德吸管吸除磁铁上的铁颗粒。重复该过程多次。</li>
	<li>配制 1 ml 消化液，其中含 2,400–2,500 单位 I 型胶原酶和 0.6 mg 大豆胰蛋白酶抑制剂，溶解于含去铁胺的缓冲液中。通过滤器除菌处理消化液。</li>
	<li>将细胞悬液体积调整至 40 ml，加入 1 ml 消化液。室温孵育 17 分钟，期间轻柔混匀悬液；在 4 °C 下以 50 × g 离心 2 分钟，吸除上清液，加入新鲜的含去铁胺缓冲液。</li>
	<li>重复多次磁铁去铁操作，再次离心收集细胞，吸除上清液后加入 46 ml 无葡萄糖培养基。</li>
	<li>轻柔混匀后，取 500 μl 悬液分装至两个预先称重的 Eppendorf 管中。以 10,000 × g 离心 1 分钟，吸除上清液后称量沉淀物重量。计算湿重总量及蛋白总量。</li>
	<li>将细胞以 1 mg 蛋白/皿的密度接种于无菌 35 mm 培养皿中，使用无葡萄糖 DMEM/F12 培养基。在 37 °C（95% 空气 / 5% CO2）培养箱中，始终置于旋转摇床上进行培养，每皿加入 2 ml 无葡萄糖 DMEM/F12 培养基。1,2</li>
</ol>
2. 肾近端小管细胞培养
<ol>
	<li>培养基为不含酚红、丙酮酸和葡萄糖的DMEM与Ham's F-12营养混合物按50:50比例混合而成，添加15 mM NaHCO3、15 mM HEPES和6 mM乳酸盐（pH 7.4，295 mosmol/kgH2O）。每日换液前立即向培养基中添加L-抗坏血酸-2-磷酸（50 μM）、牛胰岛素（10 nM）、人转铁蛋白（5 mg/ml）、氢化可的松（50 nM）和硒（5 ng/ml）。</li>
	<li>采用无菌技术吸除培养皿中的旧培养基。使用无菌技术向每个培养皿中加入2 ml温热的新鲜培养基。肾近端小管上皮细胞（RPTC）在接种后约5–6天达到汇合状态。1,2</li>
</ol>
3. 肾近端小管上皮细胞的腺病毒感染
<ol>
	<li>在每日更换培养基后，对汇合且处于静止状态的RPTC培养物进行腺病毒感染。通过以下方式构建显性失活的PKC-ε突变体（dnPKC-ε）：1）将ATP结合位点第436位的赖氨酸替换为精氨酸；2）将假底物结构域第159位的丙氨酸替换为谷氨酸。这些突变破坏了该构建体的激酶活性，但未改变PKC-ε的活性构象。3 通过删除其抑制性假底物结构域中第154-163位的氨基酸残基，使PKC-ε处于持续活化状态。4</li>
	<li>向每皿中加入携带caPKC-ε cDNA或dnPKC-ε cDNA的腺病毒储存液，以达到所需的感染复数（MOI），从而显著提高PKC-ε蛋白水平。将RPTC与腺病毒共同孵育24小时，随后更换培养基并继续培养24小时。使用编码caPKC-ε的腺病毒载体在MOI为25-50时，可显著提高磷酸化及总PKC-ε蛋白水平。更高的MOI可导致活性PKC-ε水平进一步升高，但由于会引起快速的细胞死亡和脱落，因此不建议在RPTC中使用。在RPTC中使用MOI为50-100时，可显著提高无活性PKC-ε蛋白水平，且不会产生不良影响。5</li>
	<li>感染48小时后，吸除培养基，用PBS洗涤单层细胞，并收集细胞进行免疫印迹分析，以测定PKC-ε蛋白水平。5</li>
</ol>
4. 肾小管上皮细胞呼吸作用的测定
<ol>
	<li>配制用于测定状态3呼吸的缓冲液（120 mM KCl、5 mM KH2PO4、10 mM HEPES、1 mM MgSO4 和 2 mM EGTA，pH 7.4）。测定复合物I偶联的状态3呼吸时，在缓冲液中添加5 mM谷氨酸、5 mM苹果酸和0.1 mg/ml皂苷；测定复合物II偶联的状态3呼吸时，添加10 mM琥珀酸、0.1 μM鱼藤酮和0.1 mg/ml皂苷；测定复合物IV偶联的状态3呼吸时，添加1 mM抗坏血酸、1 mM N,N,N',N'-四甲基对苯二胺（TMPD）和0.1 mg/ml皂苷。将上述溶液置于37 °C水浴中预温。</li>
	<li>吸除含有肾近端小管上皮细胞（RPTC）单层的培养皿中的培养基，加入2 ml预温的状态3呼吸缓冲液，用橡胶刮棒轻轻刮下细胞，并将细胞悬液转移至配备克拉克型氧电极的耗氧量测定 chamber 中。</li>
	<li>测定状态2呼吸（无ADP存在时）。加入ADP至终浓度0.4 mM以启动状态3呼吸。加入寡霉素至终浓度0.5 μg/ml以启动状态4呼吸。在处于状态3呼吸的细胞中加入0.5 μM FCCP，测定解偶联呼吸。6,7</li>
	<li>从chamber中收集细胞悬液，用高氯酸沉淀蛋白质，离心收集沉淀物。测定细胞沉淀中的蛋白浓度。</li>
</ol>
5. 线粒体膜电位（ΔΨm）的分析
<ol>
	<li>在无菌培养基中配制 0.5 mM 的 JC-1 溶液。</li>
	<li>向每皿中缓慢加入 20 μl JC-1 溶液，使终浓度为 5 μM。轻轻晃动培养皿使染料充分混匀。将培养皿放回培养箱中孵育 30 分钟。</li>
	<li>将培养皿置于冰上，吸除培养基，用预冷的 PBS 缓冲液洗涤单层细胞两次。吸除 PBS，加入 1 ml 新鲜 PBS，用细胞刮刀将细胞从培养皿中刮下并转移至离心管中。通过反复吹打将细胞团块分散成单细胞悬液。</li>
	<li>以 1,000 × g 离心 2 分钟，吸除上清液，向沉淀中加入 1 ml PBS 重悬细胞，获得单细胞悬液。如有必要，重复此步骤一次。</li>
	<li>以 1,000 × g 离心 2 分钟，吸除上清液，加入 0.5 ml PBS 重悬细胞沉淀。使用 488 nm 氩离子激光激发，通过流式细胞术检测荧光信号。在两个独立通道中读取发射光：FL1 通道（525 nm）和 FL2 通道（590 nm）。线粒体膜电位以 FL2/FL1 荧光比值表示。6</li>
</ol>
6. 线粒体的分离
<ol>
	<li>配制分离缓冲液：缓冲液 A（10 mM HEPES，225 mM 甘露醇，75 mM 蔗糖，0.1 mM EGTA，pH 7.4），缓冲液 B（含蛋白酶抑制剂、1 mM Na3VO4、1 mM NaF 的缓冲液 A），以及缓冲液 C（10 mM HEPES，395 mM 蔗糖，0.1 mM EGTA，pH 7.4）。所有步骤均在冰上操作。</li>
	<li>用预冷的 PBS 缓冲液冲洗 RPTC 单层细胞两次。将细胞刮入离心管中，500 × g 离心 5 分钟。用 1 ml 缓冲液 A 洗涤沉淀。</li>
	<li>将沉淀重悬于 1 ml 缓冲液 B 中，并将悬液转移至 2 ml Dounce 匀浆器中。</li>
	<li>在 Dounce 匀浆器中匀浆细胞，直至显微镜下观察到匀浆液中大多数细胞已破裂。</li>
	<li>将匀浆液在 4 °C 下以 1,000 × g 离心 5 分钟。收集上清液，并在 4 °C 下以 15,000 × g 离心 10 分钟。</li>
	<li>弃去上清液，将含有粗线粒体的沉淀重悬于 1 ml 缓冲液 C 中。将上清液在 4 °C 下以 15,000 × g 再次离心 10 分钟。重复洗涤沉淀两次。5</li>
	<li>为测定呼吸链复合物活性，将线粒体沉淀重悬于 50–100 μl 测定缓冲液中，液氮中速冻，然后在冰上缓慢解冻样品。</li>
</ol>
7. NADH-泛醌氧化还原酶（复合物 I）活性的测定
<ol>
	<li>配制测定缓冲液：10 mM KH2PO4、5 mM MgCl2，pH 7.2。加入无脂肪酸的 BSA 和 NADH，使其终浓度分别为 0.25% 和 0.25 mM。加入 2 μl 抗霉素 A 溶液（1 mg/ml），使其终浓度为 2 μg/ml。</li>
	<li>在 48 孔透明板中进行样品检测。设置一个空白对照样品，包含所有添加物但不含线粒体。向每个孔中加入 500 μl 含添加物的测定缓冲液和线粒体，将板在 30 °C 下孵育并混匀 5 分钟。</li>
	<li>通过向每个孔中加入 10 μl 3.25 mM 泛醌启动反应。以 20 秒为间隔，记录 3 分钟内的吸光度（340 nm）。然后向每个孔中加入 5 μl 鱼藤酮溶液（1 mg/ml），再记录 2 分钟的吸光度。将鱼藤酮敏感的 NADH 氧化速率计算为复合物 I 活性。7</li>
</ol>
8. 琥珀酸-泛醌氧化还原酶（复合体 II）活性的测定
<ol>
	<li>配制测定缓冲液，其中包含0.25%无脂肪酸BSA、20 mM琥珀酸钾、0.25 mM 2,6-二氯靛酚、2 μg/ml抗霉素A和10 μg/ml鱼藤酮。</li>
	<li>在48孔透明板中每个样品设置两个复孔，并设一个空白对照孔（包含所有添加物但无线粒体）。向每孔加入500 μl含有添加物和线粒体的测定缓冲液，在30 °C下振荡孵育2 min。</li>
	<li>通过向每孔加入10 μl 3.25 mM辅酶Q10启动反应。以20秒为间隔，记录595 nm波长下吸光度变化，持续3 min。通过监测2,6-二氯靛酚的还原反应计算复合体II活性。7</li>
</ol>
9. 泛醇-细胞色素c氧化还原酶（复合体III）活性的测定
<ol>
	<li>配制含有0.1%无脂肪酸BSA、80 mM琥珀酸钾、10 μg/ml鱼藤酮和0.24 mM氰化钾的测定缓冲液。</li>
	<li>在48孔透明板中每个样品设两个复孔，并设一个空白对照孔（包含所有添加物但不含线粒体）。向每孔加入291 μl含有添加物和线粒体的测定缓冲液，在30 °C下振荡孵育5分钟。</li>
	<li>通过向每孔加入3 μl 6 mM氧化型细胞色素c启动反应，以20秒为间隔记录550 nm波长下吸光度变化，持续3分钟。随后向每孔加入5 μl抗霉素A溶液（1 mg/ml），继续记录吸光度2分钟。通过抗霉素A敏感的细胞色素c还原速率计算复合体III活性。7</li>
</ol>
10. 细胞色素氧化酶（复合体 IV）活性的测定
<ol>
	<li>通过向9 mM细胞色素c溶液中加入抗坏血酸钠，并在含5 mM MgCl2的磷酸盐缓冲液（10 mM KH2PO4，pH 7.2）中于4 °C透析过夜，制备还原型细胞色素c。配制含0.1%无脂肪酸BSA和抗霉素A（2 μg/ml）的测定缓冲液。</li>
	<li>在48孔透明板中进行样品检测，设置一个除不含线粒体外其余成分均相同的空白对照。向每孔加入233 μl含添加物和线粒体的测定缓冲液，于30 °C振荡孵育5分钟。</li>
	<li>通过加入还原型细胞色素c（终浓度90 μM）启动反应。以20秒间隔记录550 nm处吸光度变化，持续3分钟。向每孔加入2 μl KCN溶液（8 μg/ml），再记录吸光度2分钟。以KCN敏感的细胞色素c氧化速率计算复合体IV活性。7</li>
</ol>
11. F0F1-ATP酶（ATP合酶）活性的测定
<ol>
	<li>制备 F0F1- ATP酶检测缓冲液（10 mM Tris-HCl，200 mM KCl，2 mM MgCl₂）2 ，pH 8.2）。用测定缓冲液重悬线粒体沉淀，将线粒体样品在液氮中速冻，然后在冰上缓慢解冻。</li>
	<li>在48孔透明板中每组样本设三个复孔。每个处理组中，2个孔用于测定总ATP酶活性（加入275 μl测定缓冲液、5 μl线粒体悬液和5 μl 95%乙醇），1个孔用于测定寡霉素不敏感ATP酶活性（加入275 μl测定缓冲液、5 μl线粒体悬液和5 μl溶于95%乙醇的1 mg/ml寡霉素溶液）。</li>
	<li>在31 °C下振荡孵育样品10分钟。加入16 μl 100 mM ATP溶液（pH 7.0），于31 °C下继续振荡孵育5分钟。</li>
	<li>将200 μl孵育混合物转移至含有50 μl 3 M TCA的离心管中。冰上孵育10分钟，于4 °C以10,000 × g离心5分钟。分别使用上清液和沉淀测定磷酸盐含量和蛋白质含量。</li>
	<li>使用无机磷酸盐检测试剂盒测定上清液中的磷酸盐含量。通过加入0.88 g FeSO₄4 至10 ml的3.75 M H2SO4 并用 H 调至 90 ml2O. 加入10 ml 钼酸铵溶液（0.66 g/10 ml H2O) 加入 FeSO₄ 溶液4 在 H2SO4避光。</li>
	<li>将每种磷酸盐标准品（0 - 1,000 μM KH₂PO₄）各50 μl加入96孔板中2PO4) 以及每种上清液各50 μl，设两个复孔。每孔加入250 μl萨姆纳试剂（Sumner Reagent），将酶标板置于30 °C孵育15分钟，并持续振荡。</li>
	<li>在室温下测定 595 nm 处的吸光度。0F1-ATP酶活性通过测定寡霉素敏感的无机磷（Pi）释放量来确定i 来自ATP，如我们先前所述。7,8计算总F值和寡霉素不敏感F值0F1-ATP酶活性。计算寡霉素敏感型ATP酶活性时，用总ATP酶活性减去寡霉素不敏感型ATP酶活性。 8,9</li>
</ol>
12. 细胞内ATP含量的测定
<ol>
	<li>将含有RPTC单层细胞的培养皿置于冰上，吸除培养基，用预冷的PBS缓冲液洗涤单层细胞两次。每份单层细胞中加入1 ml PBS，用细胞刮刀将细胞刮入PBS中，并将细胞悬液收集至Eppendorf管中。将Eppendorf管在微量离心机中离心5秒。</li>
	<li>使用ATP生物发光检测试剂盒HS II（Roche）及厂家提供的操作说明，通过荧光素酶法测定每份RPTC样品中的ATP含量。测定每份样品的蛋白浓度，并计算每毫克蛋白所含的ATP浓度。8</li>
</ol>
13. 线粒体形态的观察
<ol>
	<li>更换培养基。向每皿中加入 2 μl 的 100 μM MitoTracker Red 580 溶液（终浓度 100 nM），然后将培养皿放回培养箱中孵育 30 分钟。</li>
	<li>使用水浸物镜，在荧光显微镜下观察活细胞单层。5</li>
</ol>
14. 细胞活力分析
<ol>
	<li>在开始实验前24小时，配制50 mM顺铂溶液，用于处理将作为细胞凋亡阳性对照（annexin V阳性细胞）的细胞。同时，配制500 mM的叔丁基过氧化氢（tert-butylhydroperoxide）溶液，用于处理将作为胀亡（oncosis）阳性对照（碘化丙啶阳性细胞）的细胞。</li>
	<li>用2 μl的50 mM顺铂处理2个培养皿，用2 μl的500 mM tert-butylhydroperoxide处理另外2个培养皿。另设1个培养皿作为无染色对照。</li>
	<li>在顺铂和TBHP处理24小时后，配制结合缓冲液（10 mM Hepes、140 mM NaCl、5 mM KCl、1 mM MgCl2、1.8 mM CaCl2）以及碘化丙啶（PI）溶液（50 μg/ml），溶于结合缓冲液中。</li>
	<li>用结合缓冲液洗涤单层细胞一次。除无染色对照和annexin V阳性细胞外，向每个培养皿中加入1 ml冰冻结合缓冲液和50 μl PI溶液。盖好培养皿，置于冰上，轻轻振荡孵育15分钟。</li>
	<li>用结合缓冲液洗涤单层细胞（10分钟），除无染色对照和PI阳性细胞外，向每个培养皿中加入1 ml结合缓冲液和2 μl Annexin V-FITC溶液。盖好培养皿，在室温下轻轻振荡孵育10分钟。</li>
	<li>吸去缓冲液，用1 ml冰冻结合缓冲液在冰上洗涤单层细胞10分钟，并轻轻振荡。重复洗涤步骤一次。</li>
	<li>吸去结合缓冲液，向每个培养皿中加入500 μl结合缓冲液。用橡胶刮棒轻轻刮下细胞，并将细胞转移至流式细胞术检测管中。通过反复吹打使细胞分散成单细胞悬液，彻底打散任何细胞团块。</li>
	<li>立即使用流式细胞术检测PI和Annexin V-FITC荧光，激发波长为488 nm，PI和FITC的发射波长分别为590 nm和530 nm。每份样品计数10,000个事件。</li>
	<li>在流式细胞术点图中，将FITC荧光信号置于X轴，PI荧光信号置于Y轴。Annexin V阳性而PI阴性的细胞视为凋亡细胞；PI阳性而Annexin V阴性的细胞视为胀亡细胞。10,11</li>
</ol>

<ol><li>Nowak, G., Schnellmann, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+culture+conditions+stimulate+gluconeogenesis+in+primary+cultures+of+renal+proximal+tubule+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Improved culture conditions stimulate gluconeogenesis in primary cultures of renal proximal tubule cells.</a> Am. J. Physiol. 268, C1053-C1061 (1995).</li>
<li>Nowak, G., Schnellmann, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-ascorbic+acid+regulates+growth+and+metabolism+of+renal+cells%3A+improvements+in+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">L-ascorbic acid regulates growth and metabolism of renal cells: improvements in cell culture.</a> Am. J. Physiol. 271, 2072-2080 (1996).</li>
<li>Ping, P., Takano, H., Zhang, J., Tang, X. L., Qiu, Y., Li, R. C., Banerjee, S., Dawn, B., Balafonova, Z., Bolli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isoform-selective+activation+of+protein+kinase+C+by+nitric+oxide+in+the+heart+of+conscious+rabbits%3A+a+signaling+mechanism+for+both+nitric+oxide-induced+and+ischemia-induced+preconditioning%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Isoform-selective activation of protein kinase C by nitric oxide in the heart of conscious rabbits: a signaling mechanism for both nitric oxide-induced and ischemia-induced preconditioning.</a> Circ. Res. 84, 587-604 (1999).</li>
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<li>Cummings, B. S., Schnellmann, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cisplatin-induced+renal+cell+apoptosis%3A+caspase+3-dependent+and+-independent+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Exp.+Ther%22%5BJournal%5D)">Cisplatin-induced renal cell apoptosis: caspase 3-dependent and -independent pathways.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 302, 8-17 (2002).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

本文所述方法可在肾近端小管上皮细胞的原代培养体系中实现蛋白激酶C（PKC）各同工酶的过表达。该方法具有多项优势：1. 可在细胞类型均一的肾近端小管上皮细胞群体中研究多种损伤因素（如缺血、缺氧、氧化应激）、药物及肾毒性物质作用的调控机制，而此类细胞正是肾脏内上述刺激的主要靶细胞；2. 可在该细胞模型中研究线粒体功能 体外 在改良条件下原代培养的RPTC模型类似于肾近端小管的线粒体功能 在体.1,2 3. 线粒体对不同毒物的反应 体外 模型类似于肾近端小管的反应 体内4. 这种方法可实现高效的转染和特定蛋白编码基因的递送，包括参与调控线粒体功能的信号转导机制相关蛋白。因此，该模型允许选择性表达组成型激活或失活的激酶与磷酸酶同工酶，从而避免使用选择性较差且常伴有毒性副作用的药理学抑制剂和激活剂。该模型的局限性如下：1. 使用培养的RPTC细胞在体外环境中 体外 环境无法用于研究参与调控肾近端小管线粒体功能的内分泌和旁分泌信号 体内 2. 该模型无法用于研究慢性状况。

<table><tbody><tr><td>层流罩</td><td>Thermo Electron Corporation</td><td>FORMA 1104</td><td></td></tr><tr><td>2 ml 和 15 ml 玻璃匀浆器</td><td>WHEATON</td><td>989-24607, 357544</td><td></td></tr><tr><td>85 和 235 微米尼龙筛网</td><td>Small Parts</td><td>CMN - 0085 - 10YD CMN - 0250 - 10YD</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 无菌离心管</td><td>BIOLOGIX</td><td>BCT-P 50BS</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml 微量离心管</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.001</td><td></td></tr><tr><td>35 × 10 mm 无菌培养皿</td><td>Corning</td><td>430165</td><td></td></tr><tr><td>Jouan 离心机</td><td>Jouan</td><td>Jouan CR3 11175704 转子：Jouan T40</td><td></td></tr><tr><td>可调微型离心机</td><td>SIGMA</td><td>Model 1 - 15</td><td></td></tr><tr><td>生物氧监测仪</td><td>YSI Incorporated</td><td>YSI Model 5300A</td><td></td></tr><tr><td>单室微氧系统</td><td>YSI Incorporated</td><td>5356S</td><td></td></tr><tr><td>氧探针</td><td>YSI Incorporated</td><td>5331A</td><td></td></tr><tr><td>循环水浴</td><td>YSI Incorporated</td><td>5310</td><td></td></tr><tr><td>KCl 和标准膜试剂盒</td><td>YSI Incorporated</td><td>5775</td><td></td></tr><tr><td>磁力搅拌器</td><td>YSI Incorporated</td><td>5222</td><td></td></tr><tr><td>平板记录仪</td><td>Kipp Zonen</td><td>BD 11E</td><td></td></tr><tr><td>48 孔和 96 孔透明板</td><td>Costar</td><td>3548, 3679</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer R</td><td>Eppendorf</td><td>5355 21919</td><td></td></tr><tr><td>轨道摇床 MAXQ 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td>SHKA 2000</td><td></td></tr><tr><td>Spectra FLUOR Plus（吸光度/荧光/发光检测仪）</td><td>Tecan</td><td>F129005</td><td></td></tr><tr><td>水套式 US Autoflow 自动 CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 培养箱</td><td>NUAIRE</td><td>NU 4850</td><td></td></tr><tr><td>用于流式细胞术的 12×75 mm 聚苯乙烯培养试管</td><td>Fisher Brand</td><td>14-961-20</td><td></td></tr><tr><td>Axioskop&lt;br/&gt; 水浸物镜 63x / 0,90W</td><td>Carl Zeiss</td><td>114846&lt;br/&gt; ACHROPLAN 44 00 67</td><td></td></tr><tr><td>DMEM / F12</td><td>Cellgro</td><td>99 - 830 - PB</td><td></td></tr><tr><td>DMEM / F12 Ham</td><td>Sigma</td><td>D 2906 - 1L</td><td></td></tr><tr><td>甲磺酸去铁胺</td><td>Hospira</td><td>D110</td><td></td></tr><tr><td>I 型胶原酶</td><td>Worthington</td><td>4196</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶抑制剂</td><td>Sigma</td><td>T 6522 - 500mg</td><td></td></tr><tr><td>5,5',6,6'-四氯-1,1',3,3'-四乙基苯并咪唑羰花青碘化物（JC-1）</td><td>Invitrogen</td><td>T3168</td><td></td></tr><tr><td>Mitotracker Red</td><td>Invitrogen</td><td>M22425</td><td></td></tr><tr><td>ATP 生物发光检测试剂盒 HS II</td><td>Roche</td><td>11 699 709 001</td><td></td></tr><tr><td>Annexin V - FITC 溶液</td><td>BioVision</td><td>1001 - 200</td><td></td></tr><tr><td>流式细胞仪</td><td>BD Biosciences</td><td>BD FACSCalibur</td><td></td></tr></tbody></table>

过表达蛋白激酶c同工酶的肾细胞中线粒体功能与细胞活力的评估

Assessment of Mitochondrial Functions and Cell Viability in Renal Cells Overexpressing Protein Kinase C Isozymes

蛋白激酶C（PKC）同工酶家族参与多种生理与病理过程。我们近期的研究数据表明，PKC调控线粒体功能和细胞能量状态。大量报道显示，PKC-α和PKC-ε的激活可改善缺血心脏中的线粒体功能，并介导心脏保护作用。相反，我们已证明PKC-α和PKC-ε参与肾毒性物质诱导的肾细胞线粒体功能障碍和细胞死亡。因此，本研究的目的是建立一种 体外 维持活跃线粒体功能的肾细胞模型，其中可选择性激活或抑制PKC同工酶，以确定其在调控氧化磷酸化和细胞存活中的作用。肾近端小管细胞（RPTC）原代培养物在优化条件下培养，其线粒体呼吸及线粒体酶活性与体内RPTC相似 体内由于传统的转染技术（如Lipofectamine、电穿孔）在原代培养细胞中效率较低，且对线粒体功能具有不利影响，因此通过腺病毒载体将PKC-ε突变体cDNA导入RPTC。该方法可实现超过90%的培养RPTC转染效率。
本文介绍了评估PKC-ε在以下两方面作用的方法：1. 调控线粒体形态及与ATP合成相关的功能；2. 原代培养肾近端小管上皮细胞（RPTC）存活率。通过过表达组成型活性的PKC-ε突变体来激活PKC-ε，通过过表达无活性的PKC-ε突变体来抑制PKC-ε。线粒体功能通过检测呼吸功能、呼吸链完整性、呼吸链复合物及F0F1-ATP酶活性、ATP生成速率和ATP含量来评估。呼吸功能在经皂苷（digitonin）透化处理的RPTC中测定，包括状态3呼吸（在过量底物和ADP存在下的最大呼吸）和解偶联呼吸。呼吸链的完整性通过测定分离线粒体中呼吸链全部四个复合物的活性来评估。氧化磷酸化能力通过测定线粒体膜电位、ATP生成速率以及F0F1-ATP酶活性来评价。RPTC的能量状态通过测定细胞内ATP含量来评估。活细胞中的线粒体形态使用MitoTracker Red 580（一种可特异性在线粒体中富集的荧光染料）进行可视化，并在荧光显微镜下观察活单层细胞。RPTC的存活率通过annexin V/碘化丙啶（propidium iodide）染色结合流式细胞术检测，以判断细胞凋亡和胀亡（oncosis）。
这些方法可实现对单个蛋白激酶C同工酶的选择性激活或抑制，从而在可复制的多种生理和病理条件下评估其在细胞功能中的作用。 体外.

图1显示，通过腺病毒递送编码蛋白激酶C-ε（PKC-ε）的组成型活性突变体（caPKC-ε）和失活突变体（dnPKC-ε）的cDNA，可显著提高肾近端小管上皮细胞（RPTC）及其线粒体中PKC-ε的蛋白水平。携带caPKC-ε载体的cDNA感染细胞后，PKC-ε的磷酸化（活性）形式过表达；而携带编码dnPKC-ε的cDNA感染的细胞则过表达了无活性（未磷酸化）的PKC-ε（图1）。活性PKC-ε的存在会降低RPTC中线粒体的呼吸功能，且该效应不受用于激活线粒体的底物类型影响，而失活的PKC-ε则无此作用（图2）。为了确定活性PKC-ε在呼吸链中的作用靶点，我们检测了呼吸链中所有酶复合体的活性。如图3所示，PKC-ε的激活会降低RPTC中复合体I和复合体IV的活性，但对复合体II和复合体III的活性无显著影响（数据未显示）。由PKC-ε激活所引起的RPTC呼吸功能下降，伴随着线粒体膜电位的升高（即线粒体超极化）（图4）。这些变化同时伴随着从过表达活性PKC-ε的RPTC中...

本文描述了蛋白激酶C（PKC）同工酶激活对与呼吸和氧化磷酸化相关的线粒体功能以及细胞活力的影响。该方法采用腺病毒技术在原代细胞培养中选择性地过表达PKC同工酶，并结合多种检测手段以评估线粒体功能和细胞的能量状态。

过表达蛋白激酶C同工酶的肾细胞中线粒体功能与细胞活力的评估

蛋白激酶C（PKC）同工酶家族参与多种生理与病理过程。我们近期的研究数据表明，PKC……

本实验通过选择性调控蛋白激酶C同工型，以确定其在不同生理和病理条件下对肾近端小管细胞中线粒体及细胞功能的影响。首先，从肾皮质中分离原代肾近端小管细胞，或获取具有氧化代谢特性的肾近端小管细胞，其代谢特征与肾近端小管相似。使用表达蛋白激酶C活性形式和非活性形式的腺病毒载体在体内感染RPC细胞，然后检测不同的线粒体功能和细胞活力，以确定该同工酶对线粒体合成ATP能力及抑制细胞死亡的作用。同时对收集的细胞裂解液进行磷酸化蛋白激酶C epsilon的免疫印迹分析。结果表明，蛋白激酶ε的激活会负向调控线粒体生成ATP的能力，降低细胞内ATP水平以及肾近端小管上皮细胞的存活率。与现有的细胞系等技术相比，该方法的主要优势在于，肾近端小管上皮细胞的原代培养能够维持肾近端小管的分化功能和氧化代谢特性。由于蛋白激酶可作为靶点及潜在的治疗剂，该技术的应用前景可延伸至治疗领域，用于预防肾脏损伤或促进损伤后肾脏的修复。该方法可深入了解损伤与修复的机制。此外，该方法还可应用于新鲜分离的兔肾，依次用50毫升无菌D-M-E-M-F 12培养基、无菌磷酸盐缓冲液（pH 7.4）和PBS铁氧化物溶液灌注，以获取每个肾脏的皮质组织。首先使用15毫升下冲式匀浆器对组织进行匀浆。然后将匀浆液通过两个无菌网筛过滤至一个1升无菌烧杯中。用含有去铁胺的缓冲液冲洗残留在筛网上的细胞。将残留于底部的任何组织转移至含有去铁胺的缓冲液中，该缓冲液为40毫升，置于锥形离心管内。用强磁铁轻轻混合细胞悬液。捕获含铁的肾小球，并吸除附着在磁铁上的铁颗粒。将细胞悬液的体积调整至40毫升，加入1毫升含有胶原酶的消化液。在室温下孵育17分钟。轻轻混匀悬浮液。在多次洗涤后，于4°C条件下以50 × g离心2分钟收集细胞。将细胞沉淀重悬于46毫升不含葡萄糖的培养基中。将原代肾小管上皮细胞（RPTCs）以每皿1 mg蛋白密度接种于2 mL无葡萄糖的D-M-E-M-F12培养基中，在37°C、5%二氧化碳条件下置于旋转摇床上培养。更换培养基后，用携带编码组成型激活蛋白激酶Cε或显性失活蛋白激酶Cε的cDNA的腺病毒转染汇合的RPT细胞，孵育24小时，随后更换培养基，并继续培养转染后的原代RPTCs 24小时。为观察原代细胞单层的线粒体形态，更换培养基后加入MitoTracker Red 580，将培养皿放回培养箱孵育30分钟。然后使用水浸物镜在荧光显微镜下观察活细胞单层。目标二：通过配备克拉克型电极的氧消耗室，评估肾近端小管上皮细胞（RPTC）悬液的三态呼吸，以评价线粒体功能。首先，在无解偶联剂（DP）的条件下测定状态二呼吸。然后加入解偶联剂（DP），使其终浓度为0.4毫摩尔。为启动状态三呼吸，进行状态四呼吸测定。加入寡霉素，使其终浓度为0.5微克/毫升。通过向处于状态三呼吸的细胞中加入 0.5 微摩尔 FCCP，同时测定解偶联呼吸的数值。向每皿 RPTC 培养物中缓慢加入 20 微升 0.5 毫摩尔 JC-1 溶液，并轻轻摇晃以充分混匀染料。将培养皿放回培养箱中孵育 30 分钟。接下来，将培养物置于冰上，并用预冷的 PBS 洗涤两次。然后收集细胞。将 RPT 细胞转移至离心管中，通过吹打将单层细胞分散成单细胞悬液。使用488纳米氩离子激光激发，通过流式细胞术分析荧光。然后计算分离线粒体的线粒体膜电位。以评估呼吸链完整性的检测。用预冷的 PBS 缓冲液洗涤 RPTC 单层细胞两次后，收集细胞并通过离心形成沉淀。将沉淀用一毫升缓冲液 A 洗涤一次，然后在 Dounce 匀浆器中匀浆细胞，直至在显微镜下观察发现匀浆液中大多数细胞已破裂。接下来，通过低速离心去除细胞碎片。在4°C条件下，以15,000 × g离心10分钟，从上清液中沉淀粗线粒体，并用缓冲液c对沉淀的线粒体进行三次洗涤。将线粒体沉淀重悬于50至100微升的测定缓冲液中，用液氮速冻，用于测定NADH泛醌氧化还原酶活性。在500微升含有添加物的测定缓冲液中加入线粒体，同时设置一个空白样品，包含所有添加物但不加线粒体。将反应体系在30°C下振荡平衡5分钟。接下来，将酶标板放入分光光度计中，并向每个孔加入 10 µL 的 3.25 mmol/L 泛醌以启动反应。以 22 秒为间隔，记录 3 分钟内 340 nm 处的吸光度变化。在类似的测定中，使用还原型细胞色素 C 作为底物，测定细胞色素 C 氧化酶的活性，用于 ATP 合酶反应。为测定各处理组的总酸性磷酸酶（APAs）活性和寡霉素不敏感的APAs活性，配制相应的反应混合液。将样品加入反应混合液中，在31摄氏度下孵育10分钟。加入TP底物启动反应，并在31摄氏度下继续孵育5分钟。将200微升孵育混合物转移至含有50微升3摩尔TCA的离心管中，冰上孵育10分钟以沉淀蛋白质，随后离心收集沉淀。然后在96孔板中每孔加入50微升磷酸盐标准品和50微升各样品上清液，每个样品设两个复孔。然后向每个孔中加入 250 µL 的萨姆纳试剂，在 30 °C 下孵育 15 分钟。随后在 595 nm 处测定吸光度。用预冷的 PBS 缓冲液将 RPTC 单层细胞洗涤两次。用1毫升PBS收集细胞，并将细胞悬液转移至离心管中。通过离心沉淀RPTC样品，并使用ATP生物发光检测试剂盒的荧光素酶法测定总蛋白（TP）含量。对于35毫米培养皿中的细胞活力分析，每组使用五个RPTC单层细胞，包括三个对照处理组：分别为坏死细胞阳性组、凋亡细胞阳性组以及无染色对照组，每组设两个培养皿。向第二组加入 2 µL 的 50 毫摩尔顺铂。加入 2 µL 的 500 毫摩尔叔丁基过氧化氢。按照随附文本中所述使用碘化丙啶对细胞进行染色后，用结合缓冲液洗涤单层细胞。接下来，按照文本方案中的说明，使用与 ZI 偶联的 ANNEXIN five 对细胞进行染色。然后轻轻收集细胞，并将其重悬于 500 微升结合缓冲液中。使用橡胶刮棒。使用移液器将细胞分散成单细胞悬液，并将细胞悬液转移至流式细胞术检测管中。将细胞充分分散为单细胞悬液。立即进行流式细胞术检测PI和FE的荧光强度。通过腺病毒递送CD NA包被的蛋白激酶C epsilon的组成型活性突变体和非活性突变体，可显著提高肾小管上皮细胞（RPTC）及线粒体中蛋白激酶C epsilon的蛋白水平。正如预期，该酶的组成型活性形式在肾小管上皮细胞（RPTC）中发生磷酸化，而显性失活酶则未被磷酸化。无论采用何种底物为线粒体提供能量，活性蛋白激酶C epsilon均会降低RPTC的线粒体呼吸；但失活的蛋白激酶C epsilon对线粒体呼吸无任何影响。有趣的是，蛋白激酶C epsilon在肾小管上皮细胞（RP TCS）中的激活会降低复合物I和复合物IV的活性。肾小管上皮细胞呼吸作用的这种降低与线粒体膜电位的升高相关。而显性负性突变体则无此效应。这些变化还伴随着从过表达活性蛋白激酶 C epsilon 的肾近端小管上皮细胞（RPTC）中分离出的线粒体内 TP 合酶活性的降低。结果，过表达活性蛋白激酶 C epsilon 的 RPTC 中 ATP 含量减少。蛋白激酶 C epsilon 的持续激活对线粒体形态产生显著影响，表现为线粒体断裂。蛋白激酶C的激活而非抑制，也会导致RPTC形态改变，引起细胞皱缩以及存活细胞的伸长。在RPCs中过表达活性蛋白激酶C epsilon所引起的线粒体效应，也与坏死性细胞死亡和凋亡性细胞死亡相关。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用腺病毒技术在原代培养细胞中过表达蛋白，以及如何评估线粒体的三磷酸腺苷（ATP）合成能力。一旦掌握，若操作得当，该技术可在四小时内完成。此外，请务必注意，腺病毒具有潜在生物安全风险，因此应采取适当的防护措施。

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评估肾细胞​​蛋白激酶C同工酶，线粒体功能及细胞活力的

本视频演示了使用细胞外通量分析法评估脑血管内皮（CVE）细胞的线粒体功能。将CVE细胞接种于细胞外通量细胞培养板中。在将细胞外通量传感器装入生物分析仪前，需对其进行水合、加载及校准。随后将含有细胞的培养板装入仪器进行分析。...

评估脑血管内皮细胞中的线粒体功能

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从培养细胞和小鼠组织中分离线粒体及其功能分析

本文概述了如何研究一种（细胞周期）激酶在线粒体中的定位，以及如何确定其在线粒体内的亚结构定位和潜在的线粒体底物或靶标。将蛋白强制表达于线粒体中，是研究目的蛋白在线粒体定位后所产生功能效应的有效工具。...

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辅酶Q过量条件下线粒体通透性转换孔开放概率的评估

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基于荧光的活体成像法定量检测HeLa细胞线粒体膜电位和超氧水平

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本文介绍了利用共聚焦显微镜和ImageJ评估线粒体裂变/融合动态的方法 通过 Dendra2...

肾近端小管细胞中线粒体分裂/融合动态的评估

了解蛋白激酶C同工酶调控肾近端小管细胞线粒体功能与细胞活力的方法。该技术利用腺病毒载体选择性调节PKC同工酶活性，评估其对线粒体呼吸、ATP合成及细胞存活的影响，为肾脏疾病治疗提供潜在靶点。

过表达蛋白激酶C同工酶的肾细胞中线粒体功能与细胞活力的评估

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