Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.

כרומטין אימונופרציפיטציה
 
Click here for the English version

כרומטין אימונופרציפיטציה

Overview

היסטונים הם חלבונים המסייעים לארגן DNA בגרעין אאוקריוטי על ידי משמש "פיגומים" שסביבם ניתן לעטוף DNA, ויוצרים קומפלקס הנקרא "כרומטין". חלבונים אלה יכולים להשתנות באמצעות תוספת של קבוצות כימיות, ושינויים אלה משפיעים על ביטוי הגנים. חוקרים משתמשים בטכניקה הנקראת אימונופרציפיטציה של כרומטין (ChIP) כדי להבין טוב יותר אילו אזורי DNA מקשרים עם שינויים ספציפיים בהיסטון או חלבונים רגולטוריים אחרים. נוגדנים משמשים כדי לבודד את חלבון העניין, ואת ה- DNA הכבול מופק לניתוח.

כאן, JoVE מציג את העקרונות מאחורי ChIP, דן שינויים ספציפיים histone ואת הקשר שלהם ביטוי גנים וארגון DNA. לאחר מכן אנו בודקים כיצד לבצע פרוטוקול ChIP, ולחקור את הדרכים שבהן מדענים משתמשים כעת בטכניקה זו.

Procedure

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

אימונופרציפיטציה של כרומטין, או "ChIP", היא טכניקה המשמשת חוקרים להערכת אינטראקציות חלבון-DNA. גורמי חלבון ממלאים תפקידים חשובים בוויסות הגנים; לא רק שהם מארגנים דנ"א בכרומוזומים, אלא גם נקשרים לרצפי דנ"א ספציפיים – הנקראים אתרי רגולציה – כדי להפעיל או להדחיק ביטוי. במהלך ChIP, הכרומטין – המורכב מדנ"א והחלבונים הקשורים אליו – הוא "אימונופרציפיטי", כלומר הוא מבודד באמצעות נוגדנים. בשיטה זו, חוקרים יכולים להעריך אילו חלבונים מקשרים עם אילו רצפי DNA.

בסרטון זה, נסקור שינויים כרומטין ותפקידיהם בוויסות אפיגנטי, וכיצד ChIP יכול לבדוק שינויים אלה. לאחר מכן נתאר הליך כללי לטכניקה זו, ולבסוף נדון באופן שבו מדענים משתמשים ב- ChIP במחקר היום.

בואו נתחיל על ידי סקירת מה הם שינויים כרומטין, וכיצד ללמוד אותם עם ChIP.

באאוקריוטים, DNA מאוחסן בגרעין על ידי "עטוף" סביב מתחמי חלבון. חלבונים אלה הם היטונים, וכל קומפלקס היסטון עטוף בדנ"א מכונה "נוקלאוזום". ביטוי גנים מוסדר על ידי "תפוסה נוקלאוזית", או אם רצועה של DNA ארוזה לתוך נוקלאוזומים. DNA מתומלל נוטה להיות ממוקם באזורים "ללא נוקלאוזומים", המאפשרים לחלבונים להתרועע עם אתרי הרגולציה של הגן, ומאפשרים ל- RNA פולימראז לבצע שעתוק.

הראיות הנוכחיות מצביעות על כך ששינויים במבנה הכרומטין המסדירים את ביטוי הגנים מתווכים על ידי שינויים כימיים שנעשו בהיסטיונים, בדרך כלל ב"זנבות " הנעים בחופשיות שלהם. הנפוצים ביותר של אלה הם אצטיל, מתיל, וקבוצות פוספט המתווספים, או הוסרו, חומצות אמינו ספציפיות, ושינויים שונים אלה histone נצפים להיות קשורים רמות שונות או מצבים שונים של ביטוי גנים.

לדוגמה, התוספת של שלוש קבוצות מתיל לשאריות הליזין ה-27 בתת-unit Histone H3 – שינוי המכונה H3K27me3 – נקשרה להשתקת גנים. לחלופין, שינוי H3K9ac, שבו קבוצת אצטיל מתווספת לשאריות ליצין 9 על histone H3, קושר עם הפעלת גנים.

שינויים Histone הם המשוערים לשחק תפקיד בוויסות האפיגנטי של ביטוי גנים על ידי סימון אזורים של כרומטין כמו "פעיל" או "שקט". מנגנון אחד שבאמצעותו שינויים histone הם האמינו להפעיל את ההשפעות שלהם הוא לגייס גורמי שעתוק או אנזימים "שיפוץ" כרומטין, האחרון שבהם פיזית להזיז את עמדות של נוקלאוזומים.

עם ChIP, שינויים ספציפיים histone יכול להיות ממוקד על ידי נוגדנים, אשר ניתן "משך למטה" יחד עם ה- DNA שמסביב. לאחר מכן, חוקרים יכולים להשתמש ב- PCR, microarrays או רצף כדי לזהות אזורי DNA הקשורים לשינויים של הייסטון של עניין. על ידי שינוי הנוגדנים המשמשים במהלך ChIP, טכניקה זו יכולה גם לעזור לאתר אזורי DNA הקשורים לגורמי שעתוק וחלבונים רגולטוריים אחרים.

עכשיו שאתם יודעים את העקרונות מאחורי ChIP, בואו נעבור הליך כללי לטכניקה זו.

בתור התחלה, תאים מעניינים נאספים ומטופלים בכימיקלים כמו פורמלדהיד, הפועלים כ"ריאגנטים "מקשרים" ומסייעים להצמיד חלבונים לרצפי ה- DNA איתם הם מקשרים על ידי הקלת היווצרות קשרים קוולנטיים ביניהם. יש לנקוט בזהירות לא "יתר על המידה" תאים עם פורמלדהיד, כמו זה יכול להשפיע על היכולת של נוגדנים לזהות שינויים histone היעד שלהם בשלבי ChIP מאוחרים יותר. כדי לעצור את תהליך הקישור הצולב, גליצין מתווסף לפתרון פורמלדהיד שבו תאים מטופלים. לאחר מכן התאים נאספים ומשוחררים כדי לשחרר את הכרומטין.

כדי לסולול כרומטין ולהגדיר במדויק את אזורי הדנ"א המקשרים להיסטונים מותאמים, הכרומטין "גזור" באופן מכני לחתיכות קטנות יותר באמצעות גלי קול – תהליך הנקרא sonication. בדרך כלל, מדענים שואפים ליצור שברי כרומטין באורך 200 עד 1000 זוגות בסיסים. ברגע שנוצרים שברי כרומטין בגודל הרצוי, מתווסף לתמיסה נוגדן, והתערובת מדגירה כדי לתת לנוגדן זמן לזהות את שינוי היסטון היעד שלה.

חרוזים מגנטיים שאליהם הנוגדנים יכולים להיקשר נכנסים לתערובת, ומשתקים את מתחמי הכרומטין הקשורים לנוגדנים. החרוזים נאספים באמצעות מתלים מגנטיים, ונשטפים מספר פעמים כדי לשטוף כל כרומטין או נוגדנים לא מאוגדים.

כדי לשחרר את הכרומטין מהם, חרוזים ממוקמים בתמיסה המכילה את SDS חומר הניקוי, ולאחר איסוף החרוזים עם מגנט, supernatant נשמר. האנזים פרוטנאז K מתווסף לתמיסה זו כדי לבזות את כל החלבונים, כולל היסטיונים, כך שניתן יהיה לבודד את רכיב ה- DNA של הכרומטין. לאחר מכן מטוהרת ומנותחת הדנ"א שנוצר.

בואו עכשיו נסתכל על איך מדענים משתמשים כיום ChIP במעבדות שלהם.

חוקרים רבים משתמשים ChIP כדי להעריך שינויים שינויים histone הביא על ידי אותות חוץ תאיים. כאן, תאים אנושיים בתרבית טופלו בציטוקינים ספציפיים, או במולקולת איתות, והוחרכה שינויים במתילציה של היסטון. על ידי בדיקת DNA ChIP עם PCR בזמן אמת, החוקרים קבעו כי - בתגובה לטיפול - גן קידוד גורם שעתוק IRF1 זכה לסימן histone מפעיל, H3K36me3. שינוי זה אפשר הן חלבון רגולטורי RNA פולימראז II לקשר עם IRF1, וכתוצאה מכך שעתוק שלה.

ChIP יכול לשמש גם כדי לקבל תובנה על שינויים ביטוי גנים המתרחשים במהלך פגיעה ברקמות והתחדשות. בניסוי זה, החוקרים פגעו ברכיב של מערכת העצבים ההיקפית בעכברים – העצב הסיאטי – ולאחר מכן השתמשו ב- ChIP כדי לחפש אינטראקציות חדשניות בין חלבון DNA במבנים אחרים של מערכת העצבים ההיקפית, כמו הגרעינים שמאגפים את חוט השדרה. מדענים הגיעו למסקנה כי בעקבות פגיעה עצבית, חלבון p53, שהוא רגולטור של תיקון DNA, נקשר לגן מעורב התחדשות רקמות, GAP43.

לבסוף, כמה מדענים עובדים לקראת ייעול הליכי ChIP כדי להגדיל את התפוקה והיעילות של ניסויים. כאן, החוקרים הצליחו "להפוך" את ChIP לאוטומטית, לאחר שמכונה ביצעה רבים מהצעדים בפרוטוקול. זה איפשר לחוקרים להעריך בו זמנית DNA הקשור למספר שינויים שונים histone, באמצעות מספר קטן יחסית של תאים - 10,000 - מניב תוצאות דומות לאלה שנראו עם מספרי תאים גדולים יותר, או עם טכניקות ChIP סטנדרטיות, "ידני".

הרגע צפית בסרטון של ג'וב על אימונופרציפיטציה של כרומטין. בסרטון זה, דנו באופן שבו דנ"א וחלבונים יוצרים כרומטין, ועל השלבים של פרוטוקול, הנקרא ChIP, שניתן להשתמש בהם כדי לזהות רצפי דנ"א הקשורים למדינות כרומטין ספציפיות או חלבונים. בחנו גם כיצד חוקרים משתמשים ומשנים את ChIP כדי להבין טוב יותר את התפקיד של אינטראקציות בין חלבון DNA במהלך ויסות גנים. כמו תמיד, תודה שצפית!

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

לא הוכרזו ניגודי אינטרסים.

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter