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크로마틴 면역침전반응
 
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크로마틴 면역침전반응

Overview

히스톤은 DNA를 감싸고 "크로마틴"이라고 불리는 복합체를 형성할 수 있는 "비계"로 봉사함으로써 진핵에서 DNA를 구성하는 데 도움이 되는 단백질입니다. 이러한 단백질은 화학 적 그룹의 첨가를 통해 변형 될 수 있으며, 이러한 변화는 유전자 발현에 영향을 미친다. 연구원은 특정 히스톤 수정 또는 그밖 유전자 조절 단백질과 연관되는 DNA 지구를 더 잘 이해하기 위하여 크로마틴 면역 침전 (ChIP)에게 불린 기술을 이용합니다. 항체는 관심있는 단백질을 분리하는 데 사용되며, 결합 된 DNA는 분석을 위해 추출된다.

여기서 JoVE는 ChIP의 원리를 제시하여 특정 히스톤 수정과 유전자 발현 및 DNA 조직과의 관계를 논의합니다. 그런 다음 ChIP 프로토콜을 수행하는 방법을 검토하고 과학자들이 현재 이 기술을 사용하는 방법을 살펴봅니다.

Procedure

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크로마틴 면역 침전, 또는 "ChIP"는 단백질 DNA 상호 작용을 평가하기 위하여 연구원에 의해 이용된 기술입니다. 단백질 요인은 유전자 조절에서 중요한 역할을 합니다. 염색체에서 DNA를 조직할 뿐만 아니라, 표현을 활성화하거나 억압하기 위해 규제 사이트라고 불리는 특정 DNA 서열에 결합합니다. ChIP 도중, DNA와 그 관련 단백질로 구성된 크로마틴은 항체의 사용을 통해 고립된다는 것을 의미하는 "면역 침전물"입니다. 이 방법을 사용하여, 연구원은 어떤 단백질이 어떤 DNA 순서와 연관되는지 평가할 수 있습니다.

이 비디오에서는 크로마틴 수정 및 후성 유전학 규제에서의 역할, 그리고 ChIP가 이러한 수정을 분석 할 수있는 방법을 검토 할 것입니다. 우리는 다음이 기술에 대 한 일반화 된 절차를 설명 하 고 마지막으로 과학자 오늘 연구에서 ChIP를 사용 하는 방법을 논의.

크로마티닌 수정이 무엇인지, 그리고 ChIP로 연구하는 방법을 검토하여 시작해 보겠습니다.

진핵생물에서 DNA는 단백질 복합체 주위에 "감싸여"됨으로써 핵에 저장됩니다. 이 단백질은 히스톤이고, 각 DNA 포장히스톤 복합체는 "뉴클레오좀"이라고 합니다. 유전자 발현은 "뉴클레오소성 점유"에 의해 조절됩니다, 또는 DNA의 스트레칭이 뉴클레오소니소로 포장되는지 여부. 전사된 DNA는 단백질이 유전자의 규제 부위와 연관될 수 있도록 하는 "뉴클레오좀 없는" 지역에 위치하고 RNA 폴리머라아제가 전사를 수행하도록 하는 경향이 있습니다.

현재 의 증거는 유전자 발현을 조절하는 크로마틴 구조의 변화가 히스톤에 화학적 변형에 의해 중재된다는 것을 시사합니다, 일반적으로 자유롭게 움직이는 "꼬리"에서. 이들 중 가장 일반적인 아 세 틸, 메 틸, 그리고 추가 되는 인산염 단, 또는 제거, 특정 아미노산, 그리고 이러한 다른 히스톤 수정 유전자 발현의 다른 수준 또는 모드와 관련 된 관찰.

예를 들어, 히스톤 서브유닛 H3에 제27회 리신 잔류물3에 3개의 메틸 군을 첨가하여 H3K27me3라고 불리는 수정은 유전자 침묵에 연결되었다. 대안적으로, 아세틸 그룹이 히스톤 H3에 제9 리신 잔류물위에 첨가되는 H3K9ac 수정은 유전자 활성화와 관련이 있다.

히스톤 수정은 크로마틴의 영역을 "활성" 또는 "침묵"으로 표시하여 유전자 발현의 후성 유전학 적 조절에 역할을 하는 가설이 있습니다. 히스톤 수정이 효과를 발휘하는 것으로 추정되는 한 가지 메커니즘은 전사 인자 또는 크로마틴 "리모델링" 효소를 모집하는 것으로, 그 중 후자는 뉴클레오좀의 위치를 물리적으로 움직입니다.

ChIP를 사용하면 특정 히스톤 수정이 주변 DNA와 함께 "아래로 당겨질 수 있는" 항체에 의해 표적으로 할 수 있습니다. 연구원은 그 때 관심의 히스톤 수정과 연관된 DNA 지구를 확인하기 위하여 PCR, 마이크로 어레이, 또는 순서를 채택할 수 있습니다. ChIP 도중 사용된 항체를 변화시킴으로써, 이 기술은 또한 전사 요인 및 그밖 규제 단백질에 묶인 DNA 지구를 찾아내는 것을 도울 수 있습니다.

이제 ChIP의 원리를 알고 있으므로 이 기술에 대한 일반화된 절차를 살펴보겠습니다.

우선, 관심 있는 세포는 포름알데히드와 같은 화학 물질로 수집되고 취급되며, 이는 "교차 연결" 시약역할을 하며, 단백질을 DNA 서열에 부착하는 데 도움을 주어 그들 사이의 공유 결합 형성을 용이하게 합니다. 이 나중에 ChIP 단계에서 자신의 목표 히스톤 수정을 인식하는 항체의 능력에 영향을 미칠 수 있기 때문에, 포름알데히드와 세포를 "이상 치료"하지 않도록주의해야합니다. 교차 연결 과정을 중지하기 위해 글리신은 세포가 치료되는 포름알데히드 용액에 첨가됩니다. 세포는 그 때 크롬을 풀어 주기 위하여 집합되고 lysed됩니다.

크롬을 용해시키고 수정된 히스톤과 연관된 DNA 영역을 정확하게 정의하기 위해 크로마틴은 초음파 처리라고 하는 음파를 사용하여 기계적으로 "전단"됩니다. 일반적으로 과학자들은 크롬마틴 조각을 길이 200~1000개의 기본 쌍을 만드는 것을 목표로 합니다. 원하는 크기의 크로마틴 단편이 생성되면, 항체가 용액에 첨가되고, 혼합물은 항체가 표적 히스톤 수정을 인식하는 시간을 주기 위해 배양된다.

항체가 결합할 수 있는 자기 구슬은 그 때 항체 관련 크로마틴 복합체를 고정하여 혼합물로 도입된다. 구슬은 자기 랙의 사용을 통해 수집되고, 어떤 결합되지 않은 크로마틴 또는 항체를 헹구기 위하여 여러 번 세척됩니다.

그들로부터 크로마틴을 방출하기 위해, 구슬은 세제 SDS를 포함하는 용액에 배치하고, 자석으로 구슬을 수집 한 후, 상퍼는 유지됩니다. 효소 단백질 효소 K는 그 때 염색석을 포함하여 모든 단백질을 저하시키기 위하여 이 해결책에 추가됩니다, 그래서 염색질의 DNA 성분이 단열될 수 있습니다. 결과 DNA는 그 때 정제되고 분석됩니다.

이제 과학자들이 현재 실험실에서 ChIP를 사용하는 방법을 살펴보겠습니다.

많은 연구원은 세포외 신호에 의해 초래된 히스톤 수정의 변화를 평가하기 위하여 ChIP를 이용합니다. 여기서, 배양된 인간 세포는 특정 사이토카인, 또는 신호 분자로 처리되었고, 히스톤 메틸화의 변화를 평가하였다. 실시간 PCR로 ChIP DNA를 assaying에 의해, 연구원은 그-치료에 대 한 응답-전사 인자-인코딩 유전자 IRF1 활성화 히스톤 마크를 얻었다 결정, H3K36me3. 이러한 수정으로 인해 규제 단백질과 RNA 폴리머라제 II가 IRF1과연결되어 전사가 발생했습니다.

ChIP는 또한 조직 상해 및 재생 도중 생기는 유전자 발현에 있는 변경에 통찰력을 얻기 위하여 이용될 수 있습니다. 이 실험에서, 연구원은 마우스에 있는 말초 신경계의 분대를 손상했습니다 - sciatic 신경 - 그리고 척수를 좌우하는 신경망 같이 그밖 말초 신경계 구조물에 있는 새로운 DNA 단백질 상호 작용을 찾아는 ChIP를 이용했습니다. 과학자들은 신경 손상 후 DNA 수리의 조절제인 p53 단백질이 조직 재생에 연루된 유전자와 연관되었다고 결론내렸다.

마지막으로, 일부 과학자들은 실험의 처리량과 효율성을 높이기 위해 ChIP 절차를 간소화하기 위해 노력하고 있습니다. 여기서 연구원들은 ChIP를 "자동화"할 수 있었고, 기계가 프로토콜의 많은 단계를 수행하도록 했습니다. 이것은 연구원이 몇몇 다른 히스톤 수정과 관련되었던 DNA를 동시에 평가할 수 있었습니다, 세포의 상대적으로 작은 수-10,000-더 큰 세포 수로 보인 것과 유사한 결과를 산출하는, 또는 표준, "수동" ChIP 기술로 보인 결과.

당신은 크로마틴 면역 침전에 조브의 비디오를 보았다. 이 비디오에서는 DNA와 단백질이 함께 크로마틴을 형성하는 방법과 특정 크로마틴 상태 또는 단백질과 관련된 DNA 서열을 식별하는 데 사용할 수 있는 ChIP라는 프로토콜의 단계에 대해 논의했습니다. 우리는 또한 연구원이 유전자 조절 도중 DNA 단백질 상호 작용의 역할을 더 잘 이해하기 위하여 ChIP를 사용하고 수정하는 방법을 탐구했습니다. 언제나처럼, 시청주셔서 감사합니다!

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