Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Science Education
Cell Biology

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.

פלישה אסייד באמצעות מטריצות 3D
 
Click here for the English version

פלישה אסייד באמצעות מטריצות 3D

Overview

המטריצה החוץ תאית (ECM) היא רשת של מולקולות המספקות מסגרת מבנית לתאים ורקמות ומסייעת להקל על תקשורת בין-תאית. טכניקות תרבית תאים תלת-ממדיות פותחו כדי לדגמן בצורה מדויקת יותר את הסביבה החוץ-תאית הזו למחקר חוץ-תאי. בעוד תהליכי תאים רבים במהלך ההעברה באמצעות מטריצות תלת-ממד דומים לאלה הנדרשים לתנועה על פני משטחים 2D נוקשים, כולל דבקות, הגירה דרך ECM דורשת גם תאים לווסת ולפלוש רשת פולימרית זו של ECM.

בסרטון זה, נציג את המבנה והתפקוד של ECM ואת המנגנונים הבסיסיים של האופן שבו תאים נודדים דרכו. לאחר מכן, נבחן את הפרוטוקול של בדיקה להיווצרות צינור על ידי תאי אנדותל, אשר צעדיהם יכולים להיות כלליים לניסויים אחרים המבוססים על מטריצות תלת-ממדיות. נסיים על ידי בחינת מספר שאלות ביולוגיות אחרות שניתן לטפל בהן באמצעות חקירות פלישה ECM.

Procedure

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

מדענים פיתחו מודלים תלת-ממדיים כדי לחקור בצורה מדויקת יותר את תהליכי הפלישה והנדידה של תאים. בעוד שרוב מערכות תרבית התאים המסורתיות הן 2D, תאים ברקמות שלנו קיימים בתוך רשת תלת-ממדית של מולקולות המכונה מטריצה חוץ תאית או ECM. בעוד שרבים מהתהליכים המכניסטיים הנדרשים לתנועתיות תאים דו-ממדיים ותלת-ממדיים דומים, גורמים כגון קשיחות מופחתת של ECM בהשוואה למשטחי פלסטיק, הוספת ממד שלישי להגירה, והמכשול הפיזי של מעבר דרך רשת של פולימרים ארוכים ב- ECM, כולם מציבים אתגרים שונים לתא בהשוואה לנדידה דו ממדית.

וידאו זה יציג בקצרה את הפונקציה הבסיסית ואת המבנה של ECM, כמו גם את המנגנונים שבאמצעותם תאים לווסתים ועוברים דרכו. לאחר מכן, נדון בפרוטוקול כללי המשמש לחקר פלישת תאי אנדותל. לבסוף, נדגיש מספר יישומים של מטריצות תלת-ממדיות לחקר שאלות ביולוגיות שונות.

בואו נתחיל על ידי בחינת הרכב של ECM, וכיצד תאים אינטראקציה עם זה.

ה- ECM מבצע פונקציות רבות, כגון מתן תמיכה לתאים, סיוע בתקשורת בין-תאית והפרדת רקמות. הרכב ECM משתנה בין רקמות שונות ויש לו תכונות ביולוגיות שונות, אבל זה יכול להיות מסווג לשני סוגים רחבים. קרום המרתף משמש לעגן ולהפריד רקמות, בעוד מטריצה ביניים מקיפה ותומכת בתאים בתוך רקמה. המטריצה הבין-כוכבית מורכבת ברובה מקולגן חלבון סיבי, אך כוללת גם אלסטין ופיברונקטין.

מספר תהליכים ביולוגיים צריכים להתרחש כדי שתאים יעברו דרך ה- ECM. הראשון הוא הידבקות במטריצת תאים, הכולל חלבונים טרנס-מברניים הנקראים אינטרגרינים. אלה מקשרים את ה- ECM לפיגומים הפנימיים של התא, המכונה ציטוסקלטון.

תהליך נוסף הוא הסידור המבני של הציטוסקלטון של התא. זה מוביל להיווצרות של מבנים מיוחדים הנקראים פולשופודיה, שהם בליטות של התא לתוך המטריצה שמסביבו. השלב האחרון הוא אפנון ECM. זה בדרך כלל כרוך מולקולות השפלה המכונה מטריצה metalloproteases או MMPs, אשר מצטברים פולשופודיה לבזות את ECM שמסביב, להקל על פלישת תאים. בחינה של פלישת מטריצה תלת-ממדית מאפשרת למדענים לדמיין וללמוד את התהליך המורכב הזה.

עכשיו שאתם מכירים את ECM ואת האינטראקציה שלו עם תאים, בואו נעבור על פרוטוקול לחקר פלישת ECM על ידי תאי אנדותל כדי ליצור צינורות. על ידי פולחן תאים אנדותל בסביבה 3D, אפשר לדמות את התהליך הביולוגי של צמיחת כלי הדם, הידוע גם בשם אנגיוגנזה, אשר חשוב במהלך התפתחות נורמלית, כמו גם סרטן.

ראשית, תאי אנדותל הם בתרבית, השעיה תא יחיד מוכן על ידי טיפול בתאים עם פרוטאזים כגון טריפסין, והעברתם דרך מסנן רשת כדי לשבור גושי תאים. מטריצת התלת-ממד, המורכבת בדרך כלל מקולגן, פיברין, למינין או שילובים מורכבים יותר של רכיבים אלה – שניתן להכין במעבדה או להזמין מספקים מסחריים – מופשרת לאחר מכן על קרח. מאז רוב ההכנות ECM פולימר בטמפרטורות גבוהות יותר, זה מועיל לשמור על ציוד אחרים ריאגנטים קר גם כן. ההשעיה של התא מעורבבת עם תמיסת המטריצה המופשרת להטמעת תאים, ותערובת זו ממוקמת באינקובטור תרבית תאים שבו הטמפרטורה הגבוהה יותר תגרום למטריצה להתכלות.

לאחר הגדרת המטריצה המכילה תאים, מתווספת מדיית התרבות המכילה גורמים אנגיוגניים לצלחת המטריצה. באמצעות תוכנת מיקרוסקופיה לשגות זמן, תאים בודדים לאחר מכן ניתן לעקוב אחר נדידתם דרך המטריצה. התמונות המתקבלות מנותחות, ומיקומים של תאים משמשים לחישוב כיוון תנועה ומרחק במיקרונים. לאחר מכן ניתן להתוות ערכים אלה כדי לקבוע את פעילות הלוקומוטוריה – קצב ההעברה הממוצע של התאים. לבסוף, היווצרות רשת צינור הוא נצפה וניתח באמצעות תוכנת הדמיה כדי לזהות תכונות כגון צמתים, צינורות, לולאות.

עכשיו, בואו לחקור כמה יישומים של מטריצות 3D בניסויים ספציפיים.

נדידת תאים מתווכת על ידי אפנון פעיל של ציטוסקלטון הסלולר. בניסוי זה, מטריצות קולגן היו מוכנות וערבבו עם כתם המכיל חלבון פלואורסצנטי אדום כדי לאפשר הדמיה. כדורי תאים בודדים, שהם אשכולות תאים צפים חופשיים, היו מבודדים והוטמעו במטריצת הקולגן. לאחר הדגירה, התאים המוטמעים היו מוכתמים עבור רכיבי שלד ספציפיים, וצוותו על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. החוקרים הבחינו ברכיבי שלד ציטוס ושלד ובשינויים שלהם כאשר תאים נודדים דרך ה- ECM.

מדענים יכולים גם לחקור כיצד המאפיינים של ECM משפיעים על ההגירה. באמצעות מערכת ג'ל קונצנטרית, שבה תאים מוטבעים במטריצת ג'ל פנימית מוקפת מטריצות חיצוניות בריכוזים שונים, מדענים יכולים לעקוב אחר תאים באמצעות מיקרוסקופיה בזמן לשגות כדי לחקור את ההגירה שלהם מן הג'ל הפנימי לג'ל החיצוני בתחילה ללא תאים. החוקרים הבחינו כי נוקשות גדולה יותר של ג'לים בריכוז גבוה יותר הביאה לעלייה הן בהעתקת התאים והן במרחק הכולל של נדידת התאים.

לבסוף, בדיקות פלישת מטריצה יכולות להתבצע בתוך חיה חיה כדי לחקור אנגיוגנזה בהקשר ספציפי לאיבר. כאן נוצרו ג'ל פיברין – הנפוץ בהנדסת רקמות בשל אופיים המתכלה – ולאחר מכן השתלה לריאות עכבר שבהן הוחזקו הג'לים במקום על ידי "דבק" העשוי מפיברינוגן החלבון. נדידת תאים ויצירת כלי דם חדשים הורשו להתרחש במשך 7 עד 30 הימים הבאים, ולאחר מכן הריאות וג'לים פיברין נקצרו, תוקנו ונותחו. הדמיה של חלקים אלה חשפה כלי דם ויצירת alveoli בג'לים המושתלים, נותן לחוקרים תובנה על היבט מכריע זה של התפתחות הריאות בסביבתו in vivo.

הרגע צפית בסרטון של ג'וב על צילומי פלישה חוץ-תאיים. וידאו זה דן בהרכב של ECM וכיצד תאים נודדים דרכו, הציג פרוטוקול פשוט לחקר העברת תאים אנדותל באמצעות מטריצה תלת-ממדית, והדגיש מספר תהליכים תאיים הנחקרים כעת בהקשר של אינטראקציות תא-ECM. מכיוון שנדידת תאים אנדוגניים מתרחשת בחלל תלת-ממדי, תנאים ביולוגיים אלה מדומים בצורה הטובה ביותר על ידי טכניקות תרבות תלת-ממדיות. שיפורים בהרכב המטריצה ימשיכו לאפשר למדענים לשכפל וללמוד באופן מדויק יותר את ההגירה התאית במעבדה. כמו תמיד, תודה שצפית!

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

לא הוכרזו ניגודי אינטרסים.

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter