Overview
탠덤 질량 분석에서 관심있는 생체 분자는 생물학적 샘플에서 분리 된 다음 그 구성 및 서열을 해명하기 위해 여러 하위 단위로 단편화됩니다. 이것은 일련의 질량 분광기를 갖는 것으로 달성된다. 첫 번째 분광계는 특정 질량의 샘플을 이온화하고 충전 비율을 필터링합니다. 그런 다음 여과된 이온이 조각화되어 두 번째 질량 분광계로 전달되어 파편이 분석됩니다.
이 비디오는 질량 대 비율 선택 및 해리 방법을 포함하여 탠덤 질량 분석법의 원리를 소개합니다. 또한 충돌 유발 해리와 탠덤 질량 분광법을 사용하여 생화학 화합물을 분석하는 일반적인 절차가 도시되어 있다. 응용 분야는 선택 반응 모니터링, 단백질 번역 후 수정 의 결정 및 혈액에서 tacrolimus 수준의 검출을 다룹니다.
탠덤 질량 분광법은 생체 분자를 먼저 분리한 다음 화학 적 구성의 측면을 결정하기 위해 여러 단계의 질량 분광법을 연결합니다. 생체 분자는 크고 복잡한 구조를 가지고 있어 분자 구성을 결정하기가 어렵습니다. 탠덤 질량 분석법은 나중에 여러 하위 단위로 단편화되는 관심 있는 분자를 선택하여 식별 및 서열을 해명하는 데 도움이 됩니다. 이 비디오는 탠덤 질량 분석법, 일반적인 절차 및 생화학에 대한 사용의 일부를 보여줍니다.
탠덤 질량 분석법은 샘플을 이온으로 변환하는 이온 소스와 질량 대 전하 비율을 기반으로 이온을 분리하는 질량 분석기로 전형적인 질량 스펙 계측기로 시작됩니다. 일반적인 질량 분석기, 쿼드러폴은 특정 비율을 가진 이온만 허용하고, 다른 사람들은 장치의 막대에 충돌한다. 전구체 이온이라고 불리는 종은 관심의 생체 분자입니다. 이온은 충돌 셀, 일반적으로 예측 가능한 패턴으로 이온을 단편화하는 데 에너지가 적용되는 또 다른 쿼드러폴로 이동합니다.
이러한 조각은 이러한 "제품 이온"을 구분하는 비행 시간과 같은 다른 질량 분석기로 이동합니다. 제품 이온은 일반 MS 기기에서와 같이 검출기로 전송됩니다. 알 수 없는 단백질의 경우, 결과 스펙트럼에는 수많은 겹치는 단편이 포함되어 있어 생체 분자의 확실한 완전한 서열을 생성하기가 어렵습니다. 그러나, 스펙트럼 패턴은 주어진 단백질에 대 한 고유. 분석 소프트웨어는 스펙트럼을 알려진 펩티드 서열의 데이터베이스와 비교하여 겹치는 단편으로부터 알 수 없는 단백질을 해명한다.
시료와 원하는 조각화 정도에 따라 여러 조각화 방법이 가능합니다. 조각화 패턴은 에너지가 전송되는 방법, 그 양 및 전구체 이온을 통해 분배되는 방법에 따라 달라집니다. 에너지는 중성 입자, 방사선 또는 전자를 통해 전달될 수 있다. 중성 원자를 사용하여, 충돌 유도 해리 또는 CID에게 불린 프로세스는, 주로 아미노산 사이 펩티드 결합에서 갈라, 그들의 식별에 이상적입니다.
이제 기술의 기본이 적용되었으므로, 박테리아 세포 봉투의 구성 요소를 연구하는 데 사용되는 CID 탠덤 질량 분광법을 살펴 보겠습니다.
모든 질량 분광 실험과 마찬가지로 첫 번째 단계는 샘플을 이온화하는 것입니다. 생체 분자의 경우, 이것은 전형적으로 매트릭스 보조 레이저 탈착 또는 전기 스프레이 이온화로 수행됩니다. 전구체 이온 신호는 이온 광학의 튜닝에 의해 최적화됩니다. 완료되면 대상이 격리되고 CID와 같은 조각화 메서드가 선택됩니다.
전구체 이온을 충돌 셀로 가속화하는 적용 된 전압의 강도는 단편화 정도에 영향을 미칩니다. 이 전압은 전구체가 가장 높은 제품 이온에 비해 약 10 % 풍부 할 때까지 증가합니다. 충분한 신호 대 잡음 비율이 달성될 때까지 여러 스펙트럼을 획득하고 평균화합니다. 필요한 검사 수는 원래 전구체 이온의 신호 강도에 따라 달라지며 3에서 300까지 다양할 수 있습니다.
이 예에서 의질과, 대장균 K-12에서 지질 A는 CID 후에 19개의 주요 단편이 있었습니다. 지질 A의 일반 구조는 잘 알려져 있어 소프트웨어가 샘플에서 특정 조성물을 재구성할 수 있습니다.
이제 우리는 절차를 보았으니, 탠덤 질량 분석법이 생화학에 사용되는 몇 가지 방법을 살펴 봅시다.
탠덤 질량 분석의 일반적인 스캐닝 모드는 반응 모니터링 또는 SRM을 선택합니다. SRM에서 질량 분석기는 특정 전구체 및 제품 이온에 중점을 둔 선택된 질량 대 전하 비율로 고정됩니다. SRM의 높은 수준의 감도 때문에, 알려진 농도의 펩티드 표준의 스펙트럼을 이용하고 알 수없는 샘플의 스펙트럼을 활용할 수 있으며, 관심있는 단백질을 정량화 할 수 있습니다.
단백질은 일반적으로 번역 후에, 일반적으로 메틸 단, 인산염 단, 또는 글리칸으로 알려져 있는 설탕과 같은 기능성 단의 추가에 의해 변형됩니다. 이들은 세포 신호 프로세스에서 중요합니다, 세포가 서로 통신하는 방법을 해명합니다. 탠덤 질량 분석법은 단백질을 더 작은 성분으로 단편화하기 때문에, PTM의 위치를 특정 단편 또는 아미노산으로 결정할 수 있다. 아세틸화 및 트리메틸화와 같은 일부 수정은 질량만으로 구별하기 어렵기 때문에 크로마토그래피 분리는 질량 분광법 전에 수행됩니다.
환자의 혈액에 있는 많은 분석체는 일반적인 질량 분석법에 대한 검출의 한계 이하의 농도에서 찾아낸다. SRM의 또 다른 장점은 하나의 제품 이온을 제외한 모든 제품을 폐기하여 감도를 높이고 검출 제한을 최대 100배까지 향상시키는 것입니다. 이 예에서, 면역 억제제 약, tacrolimus는, 1 ng/mL의 수준에서 검출될 수 있었습니다.
당신은 탠덤 질량 분석에 JoVE의 비디오를 보았다. 이 비디오는 악기의 이론을 설명하고, 일반적인 절차를 거쳤으며, 기술이 현재 활용되고 있는 몇 가지 방법을 설명했습니다. 시청해 주셔서 감사합니다!
Procedure
탠덤 질량 분석에서 관심있는 생체 분자는 생물학적 샘플에서 분리 된 다음 그 구성 및 서열을 해명하기 위해 여러 하위 단위로 단편화됩니다. 이것은 일련의 질량 분광기를 갖는 것으로 달성된다. 첫 번째 분광계는 특정 질량의 샘플을 이온화하고 충전 비율을 필터링합니다. 그런 다음 여과된 이온이 조각화되어 두 번째 질량 분광계로 전달되어 파편이 분석됩니다.
이 비디오는 질량 대 비율 선택 및 해리 방법을 포함하여 탠덤 질량 분석법의 원리를 소개합니다. 또한 충돌 유발 해리와 탠덤 질량 분광법을 사용하여 생화학 화합물을 분석하는 일반적인 절차가 도시되어 있다. 응용 분야는 선택 반응 모니터링, 단백질 번역 후 수정 의 결정 및 혈액에서 tacrolimus 수준의 검출을 다룹니다.
탠덤 질량 분광법은 생체 분자를 먼저 분리한 다음 화학 적 구성의 측면을 결정하기 위해 여러 단계의 질량 분광법을 연결합니다. 생체 분자는 크고 복잡한 구조를 가지고 있어 분자 구성을 결정하기가 어렵습니다. 탠덤 질량 분석법은 나중에 여러 하위 단위로 단편화되는 관심 있는 분자를 선택하여 식별 및 서열을 해명하는 데 도움이 됩니다. 이 비디오는 탠덤 질량 분석법, 일반적인 절차 및 생화학에 대한 사용의 일부를 보여줍니다.
탠덤 질량 분석법은 샘플을 이온으로 변환하는 이온 소스와 질량 대 전하 비율을 기반으로 이온을 분리하는 질량 분석기로 전형적인 질량 스펙 계측기로 시작됩니다. 일반적인 질량 분석기, 쿼드러폴은 특정 비율을 가진 이온만 허용하고, 다른 사람들은 장치의 막대에 충돌한다. 전구체 이온이라고 불리는 종은 관심의 생체 분자입니다. 이온은 충돌 셀, 일반적으로 예측 가능한 패턴으로 이온을 단편화하는 데 에너지가 적용되는 또 다른 쿼드러폴로 이동합니다.
이러한 조각은 이러한 "제품 이온"을 구분하는 비행 시간과 같은 다른 질량 분석기로 이동합니다. 제품 이온은 일반 MS 기기에서와 같이 검출기로 전송됩니다. 알 수 없는 단백질의 경우, 결과 스펙트럼에는 수많은 겹치는 단편이 포함되어 있어 생체 분자의 확실한 완전한 서열을 생성하기가 어렵습니다. 그러나, 스펙트럼 패턴은 주어진 단백질에 대 한 고유. 분석 소프트웨어는 스펙트럼을 알려진 펩티드 서열의 데이터베이스와 비교하여 겹치는 단편으로부터 알 수 없는 단백질을 해명한다.
시료와 원하는 조각화 정도에 따라 여러 조각화 방법이 가능합니다. 조각화 패턴은 에너지가 전송되는 방법, 그 양 및 전구체 이온을 통해 분배되는 방법에 따라 달라집니다. 에너지는 중성 입자, 방사선 또는 전자를 통해 전달될 수 있다. 중성 원자를 사용하여, 충돌 유도 해리 또는 CID에게 불린 프로세스는, 주로 아미노산 사이 펩티드 결합에서 갈라, 그들의 식별에 이상적입니다.
이제 기술의 기본이 적용되었으므로, 박테리아 세포 봉투의 구성 요소를 연구하는 데 사용되는 CID 탠덤 질량 분광법을 살펴 보겠습니다.
모든 질량 분광 실험과 마찬가지로 첫 번째 단계는 샘플을 이온화하는 것입니다. 생체 분자의 경우, 이것은 전형적으로 매트릭스 보조 레이저 탈착 또는 전기 스프레이 이온화로 수행됩니다. 전구체 이온 신호는 이온 광학의 튜닝에 의해 최적화됩니다. 완료되면 대상이 격리되고 CID와 같은 조각화 메서드가 선택됩니다.
전구체 이온을 충돌 셀로 가속화하는 적용 된 전압의 강도는 단편화 정도에 영향을 미칩니다. 이 전압은 전구체가 가장 높은 제품 이온에 비해 약 10 % 풍부 할 때까지 증가합니다. 충분한 신호 대 잡음 비율이 달성될 때까지 여러 스펙트럼을 획득하고 평균화합니다. 필요한 검사 수는 원래 전구체 이온의 신호 강도에 따라 달라지며 3에서 300까지 다양할 수 있습니다.
이 예에서 의질과, 대장균 K-12에서 지질 A는 CID 후에 19개의 주요 단편이 있었습니다. 지질 A의 일반 구조는 잘 알려져 있어 소프트웨어가 샘플에서 특정 조성물을 재구성할 수 있습니다.
이제 우리는 절차를 보았으니, 탠덤 질량 분석법이 생화학에 사용되는 몇 가지 방법을 살펴 봅시다.
탠덤 질량 분석의 일반적인 스캐닝 모드는 반응 모니터링 또는 SRM을 선택합니다. SRM에서 질량 분석기는 특정 전구체 및 제품 이온에 중점을 둔 선택된 질량 대 전하 비율로 고정됩니다. SRM의 높은 수준의 감도 때문에, 알려진 농도의 펩티드 표준의 스펙트럼을 이용하고 알 수없는 샘플의 스펙트럼을 활용할 수 있으며, 관심있는 단백질을 정량화 할 수 있습니다.
단백질은 일반적으로 번역 후에, 일반적으로 메틸 단, 인산염 단, 또는 글리칸으로 알려져 있는 설탕과 같은 기능성 단의 추가에 의해 변형됩니다. 이들은 세포 신호 프로세스에서 중요합니다, 세포가 서로 통신하는 방법을 해명합니다. 탠덤 질량 분석법은 단백질을 더 작은 성분으로 단편화하기 때문에, PTM의 위치를 특정 단편 또는 아미노산으로 결정할 수 있다. 아세틸화 및 트리메틸화와 같은 일부 수정은 질량만으로 구별하기 어렵기 때문에 크로마토그래피 분리는 질량 분광법 전에 수행됩니다.
환자의 혈액에 있는 많은 분석체는 일반적인 질량 분석법에 대한 검출의 한계 이하의 농도에서 찾아낸다. SRM의 또 다른 장점은 하나의 제품 이온을 제외한 모든 제품을 폐기하여 감도를 높이고 검출 제한을 최대 100배까지 향상시키는 것입니다. 이 예에서, 면역 억제제 약, tacrolimus는, 1 ng/mL의 수준에서 검출될 수 있었습니다.
당신은 탠덤 질량 분석에 JoVE의 비디오를 보았다. 이 비디오는 악기의 이론을 설명하고, 일반적인 절차를 거쳤으며, 기술이 현재 활용되고 있는 몇 가지 방법을 설명했습니다. 시청해 주셔서 감사합니다!
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Disclosures
이해 상충이 선언되지 않았습니다.
