Overview
La cinetica enzimatica descrive gli effetti catalitici degli enzimi, che sono biomolecole che facilitano le reazioni chimiche necessarie per gli organismi viventi. Gli enzimi agiscono sulle molecole, denominate substrati, per formare prodotti. I parametri cinetici enzimatici sono determinati tramite saggi che misurano direttamente o indirettamente i cambiamenti nella concentrazione del substrato o del prodotto nel tempo.
Questo video coprirà i principi di base della cinetica enzimatica (comprese le equazioni di velocità) e i modelli cinetici. Vengono inoltre discussi i concetti che regolano i saggi enzimatici, seguiti da un tipico saggio colorimetrico. La sezione applicazioni discute un saggio enzimatico tramite analisi FRET (Förster resonance energy transfer), caratterizzando l'attività enzimatica extracellulare nell'ambiente e studiando la cinetica di riparazione del DNA utilizzando sonde molecolari.
Gli enzimi sono catalizzatori biochimici essenziali per la vita. I saggi enzimatici sono utilizzati per studiare le proprietà cinetiche delle reazioni enzimatiche, delucidando gli effetti catalitici degli enzimi. Questo video coprirà la cinetica enzimatica e i saggi, esaminerà una procedura generale e mostrerà alcuneapplicazioni.
Gli enzimi sono proteine, o meno spesso RNA, che agiscono su un reagente specifico, indicato come substrato. Un enzima riduce l'energia di attivazione necessaria per avviare una reazione biochimica, facendo sì che la reazione si verifichi a un ritmo più veloce.
Le reazioni enzimatiche possono essere suddivise in tre componenti elementari. Il primo è la formazione del complesso enzima-substrato, formato dal legame del substrato al sito attivo dell'enzima. Il complesso può decomposire nei suoi costituenti originali. Questa è la seconda reazione elementare. In alternativa, il complesso può formare il prodotto e recuperare l'enzima, la terza reazione elementare.
La cinetica di una reazione elementare è data dall'equazione della legge elementare del tasso. Le equazioni della legge del tasso danno il tasso in termini di concentrazione dei reagenti e una costante di velocità. Ciascuna delle reazioni elementari ha un'equazione di legge di velocità individuale, con la propria costante di velocità. Queste equazioni possono essere distillate in un modello cinetico noto come equazione di Michaelis-Menten. Questo dà la velocità di reazione in termini di concentrazione del substrato; che può essere determinato sperimentalmente. Alcune tendenze generali per le reazioni enzimatiche possono essere identificate usando l'equazione di Michaelis-Menten. Ad alta concentrazione di substrato, viene raggiunto un punto di saturazione, chiamato Vmax. Qui, la velocità è limitata dalla concentrazione totale dell'enzima e dal numero di molecole di substrato che un enzima converte in prodotto per un dato tempo, noto anche come kcat. Nella cinetica di Michaelis-Menten kcat è una delle due costanti che governano la velocità di reazione. L'altra costante, KM, è nota come costante di affinità. KM è anche equivalente alla concentrazione dove la velocità di reazione è equivalente a mezzo Vmax . Un enzima con un'affinità più alta avrà un KM inferiore e raggiungerà Vmax più velocemente, mentre un enzima con affinità inferiore avrà un KM più alto e impiegherà più tempo a raggiungere Vmax. Conoscere kcat e KM consente di confrontare gli enzimi. Per fare questo usiamo un rapporto chiamato efficienza enzimatica. Un kcat più alto e km più basso si traducono in efficienze più elevate, mentre ungatto k più basso e km più alto si traduce in un numero inferiore.
I fattori utilizzati per chiarire la cinetica enzimatica devono essere determinati sperimentalmente. Questi saggi vengono in genere eseguiti mescolando un enzima e una soluzione di substrato in un ambiente controllato. Le osservazioni vengono effettuate misurando le variazioni di concentrazione del substrato, del prodotto o dei sottoprodotti rispetto al tempo.
La variazione della concentrazione nel tempo viene utilizzata per determinare la velocità di reazione. Per determinare la cinetica, i dati sulla velocità devono essere ottenuti a concentrazioni multiple. Se un grafico della velocità iniziale inversa rispetto alla concentrazione iniziale inversa, nota come trama di Lineweaver-Burk, è lineare, allora la reazione segue la cinetica di Michaelis-Menten. La pendenza e l'intercetta della linea consentono la determinazione dei parametri cinetici KM e Vmax,che possono quindi essere utilizzati per calcolare kcat e l'efficienza enzimatica.
Ora che i principi della cinetica enzimatica sono stati discussi, diamo un'occhiata a come viene eseguito un tipico saggio enzimatico.
In questa procedura viene dimostrato un test colorimetrico. Il primo passo è generare una curva standard, che correlerà l'assorbanza con la concentrazione del substrato. Le soluzioni di concentrazione nota vengono preparate insieme a un campione di controllo. Viene aggiunta una soluzione di sviluppo che reagisce con il substrato per produrre un composto colorato. L'assorbanza viene misurata e tracciata rispetto alla concentrazione per generare la curva standard.
Per eseguire il test, viene preparata una concentrazione nota di substrato insieme alla quantità appropriata di enzima. L'enzima e il substrato vengono miscelati e lasciati incubare per un intervallo di tempo prestabilito. Il pH e la temperatura sono controllati con soluzioni tampone e blocchi riscaldanti. Viene aggiunto un agente di tempra per fermare la reazione. La soluzione dello sviluppatore viene quindi aggiunta alle reazioni e mescolata. Le soluzioni vengono quindi poste in cuvette e viene misurata l'assorbanza. La quantità di substrato consumato viene determinata confrontando l'assorbanza misurata con la curva standard. Utilizzando i dati raccolti, le velocità di reazione iniziali sono determinate tracciando la concentrazione nel tempo. Infine, con i dati di tasso e concentrazione, viene realizzato il grafico di Michaelis-Menten. Ciò consente la determinazione delle proprietà cinetiche per l'enzima come il numero di turnover e l'efficienza enzimatica.
Ora che abbiamo esaminato una procedura di analisi, diamo un'occhiata ad altri modi in cui vengono eseguiti i test e alle loro applicazioni.
In questa procedura l'analisi FRET viene utilizzata per studiare la cinetica di una proteasi idrolizzando un legame peptidico di una proteina. Queste emissioni possono essere misurate, consentendo un'analisi continua e quantitativa del consumo e della produzione del substrato, aiutando nella determinazione della cinetica di reazione.
I saggi enzimatici possono essere utilizzati nelle scienze ambientali per determinare i livelli di attività enzimatica extracellulare nell'ambiente. Acque, suoli e sedimenti possono essere raccolti dall'ambiente e lavorati in laboratorio. L'attività enzimatica extracellulare di questi materiali può quindi essere caratterizzata utilizzando saggi enzimatici. Questo è uno strumento utile per capire come l'ambiente elabora il materiale organico.
Il meccanismo di riparazione del DNA di una cellula può essere valutato studiando la cinetica degli enzimi presenti nel nucleo. La velocità con cui un enzima rimuove le lesioni del DNA, o danni, può essere misurata utilizzando beacon molecolari fluorescenti, che fluoresce solo quando legati a sequenze di DNA uniche. Il livello di riparazione del DNA può essere misurato in tempo reale rilevando i prodotti di scissione etichettati in modo fluorescente.
Hai appena visto il video di JoVE sulla cinetica enzimatica e sui saggi. Questo video ha spiegato la cinetica enzimatica, ha coperto i concetti di analisi, ha esaminato una procedura generale e ha descritto alcune applicazioni.
Grazie per l'attenzione!
Procedure
La cinetica enzimatica descrive gli effetti catalitici degli enzimi, che sono biomolecole che facilitano le reazioni chimiche necessarie per gli organismi viventi. Gli enzimi agiscono sulle molecole, denominate substrati, per formare prodotti. I parametri cinetici enzimatici sono determinati tramite saggi che misurano direttamente o indirettamente i cambiamenti nella concentrazione del substrato o del prodotto nel tempo.
Questo video coprirà i principi di base della cinetica enzimatica (comprese le equazioni di velocità) e i modelli cinetici. Vengono inoltre discussi i concetti che regolano i saggi enzimatici, seguiti da un tipico saggio colorimetrico. La sezione applicazioni discute un saggio enzimatico tramite analisi FRET (Förster resonance energy transfer), caratterizzando l'attività enzimatica extracellulare nell'ambiente e studiando la cinetica di riparazione del DNA utilizzando sonde molecolari.
Gli enzimi sono catalizzatori biochimici essenziali per la vita. I saggi enzimatici sono utilizzati per studiare le proprietà cinetiche delle reazioni enzimatiche, delucidando gli effetti catalitici degli enzimi. Questo video coprirà la cinetica enzimatica e i saggi, esaminerà una procedura generale e mostrerà alcuneapplicazioni.
Gli enzimi sono proteine, o meno spesso RNA, che agiscono su un reagente specifico, indicato come substrato. Un enzima riduce l'energia di attivazione necessaria per avviare una reazione biochimica, facendo sì che la reazione si verifichi a un ritmo più veloce.
Le reazioni enzimatiche possono essere suddivise in tre componenti elementari. Il primo è la formazione del complesso enzima-substrato, formato dal legame del substrato al sito attivo dell'enzima. Il complesso può decomposire nei suoi costituenti originali. Questa è la seconda reazione elementare. In alternativa, il complesso può formare il prodotto e recuperare l'enzima, la terza reazione elementare.
La cinetica di una reazione elementare è data dall'equazione della legge elementare del tasso. Le equazioni della legge del tasso danno il tasso in termini di concentrazione dei reagenti e una costante di velocità. Ciascuna delle reazioni elementari ha un'equazione di legge di velocità individuale, con la propria costante di velocità. Queste equazioni possono essere distillate in un modello cinetico noto come equazione di Michaelis-Menten. Questo dà la velocità di reazione in termini di concentrazione del substrato; che può essere determinato sperimentalmente. Alcune tendenze generali per le reazioni enzimatiche possono essere identificate usando l'equazione di Michaelis-Menten. Ad alta concentrazione di substrato, viene raggiunto un punto di saturazione, chiamato Vmax. Qui, il tasso è limitato dalla concentrazione totale dell'enzima e dal numero di molecole di substrato che un enzima converte in prodotto per un dato tempo, noto anche come kcat. Nella cinetica di Michaelis-Menten kcat è una delle due costanti che governano la velocità di reazione. L'altra costante, KM, è nota come costante di affinità. KM è anche equivalente alla concentrazione dove la velocità di reazione è equivalente a mezzo Vmax . Un enzima con un'affinità più alta avrà un KM inferiore e raggiungerà Vmax più velocemente, mentre un enzima con affinità inferiore avrà un KM più alto e impiegherà più tempo a raggiungere Vmax. Conoscere kcat e KM consente di confrontare gli enzimi. Per fare questo usiamo un rapporto chiamato efficienza enzimatica. Un kcat più alto e km più basso si traducono in efficienze più elevate, mentre ungatto k più basso e km più alto si traduce in un numero inferiore.
I fattori utilizzati per chiarire la cinetica enzimatica devono essere determinati sperimentalmente. Questi saggi vengono in genere eseguiti mescolando un enzima e una soluzione di substrato in un ambiente controllato. Le osservazioni vengono effettuate misurando le variazioni di concentrazione del substrato, del prodotto o dei sottoprodotti rispetto al tempo.
La variazione della concentrazione nel tempo viene utilizzata per determinare la velocità di reazione. Per determinare la cinetica, i dati sulla velocità devono essere ottenuti a concentrazioni multiple. Se un grafico della velocità iniziale inversa rispetto alla concentrazione iniziale inversa, nota come trama di Lineweaver-Burk, è lineare, allora la reazione segue la cinetica di Michaelis-Menten. La pendenza e l'intercetta della linea consentono la determinazione dei parametri cinetici KM e Vmax,che possono quindi essere utilizzati per calcolare kcat e l'efficienza enzimatica.
Ora che i principi della cinetica enzimatica sono stati discussi, diamo un'occhiata a come viene eseguito un tipico saggio enzimatico.
In questa procedura viene dimostrato un test colorimetrico. Il primo passo è generare una curva standard, che correlerà l'assorbanza con la concentrazione del substrato. Le soluzioni di concentrazione nota vengono preparate insieme a un campione di controllo. Viene aggiunta una soluzione di sviluppo che reagisce con il substrato per produrre un composto colorato. L'assorbanza viene misurata e tracciata rispetto alla concentrazione per generare la curva standard.
Per eseguire il test, viene preparata una concentrazione nota di substrato insieme alla quantità appropriata di enzima. L'enzima e il substrato vengono miscelati e lasciati incubare per un intervallo di tempo prestabilito. Il pH e la temperatura sono controllati con soluzioni tampone e blocchi riscaldanti. Viene aggiunto un agente di tempra per fermare la reazione. La soluzione dello sviluppatore viene quindi aggiunta alle reazioni e mescolata. Le soluzioni vengono quindi poste in cuvette e viene misurata l'assorbanza. La quantità di substrato consumato viene determinata confrontando l'assorbanza misurata con la curva standard. Utilizzando i dati raccolti, le velocità di reazione iniziali sono determinate tracciando la concentrazione nel tempo. Infine, con i dati di tasso e concentrazione, viene realizzato il grafico di Michaelis-Menten. Ciò consente la determinazione delle proprietà cinetiche per l'enzima come il numero di turnover e l'efficienza enzimatica.
Ora che abbiamo esaminato una procedura di analisi, diamo un'occhiata ad altri modi in cui vengono eseguiti i test e alle loro applicazioni.
In questa procedura l'analisi FRET viene utilizzata per studiare la cinetica di una proteasi idrolizzando un legame peptidico di una proteina. Queste emissioni possono essere misurate, consentendo un'analisi continua e quantitativa del consumo e della produzione del substrato, aiutando nella determinazione della cinetica di reazione.
I saggi enzimatici possono essere utilizzati nelle scienze ambientali per determinare i livelli di attività enzimatica extracellulare nell'ambiente. Acque, suoli e sedimenti possono essere raccolti dall'ambiente e lavorati in laboratorio. L'attività enzimatica extracellulare di questi materiali può quindi essere caratterizzata utilizzando saggi enzimatici. Questo è uno strumento utile per capire come l'ambiente elabora il materiale organico.
Il meccanismo di riparazione del DNA di una cellula può essere valutato studiando la cinetica degli enzimi presenti nel nucleo. La velocità con cui un enzima rimuove le lesioni del DNA, o danni, può essere misurata utilizzando beacon molecolari fluorescenti, che fluoresce solo quando legati a sequenze di DNA uniche. Il livello di riparazione del DNA può essere misurato in tempo reale rilevando i prodotti di scissione etichettati in modo fluorescente.
Hai appena visto il video di JoVE sulla cinetica enzimatica e sui saggi. Questo video ha spiegato la cinetica enzimatica, ha coperto i concetti di analisi, ha esaminato una procedura generale e ha descritto alcune applicazioni.
Grazie per l'attenzione!
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarato.
