İzole ve ışık-hasat antenler Diatom Cyclotella Meneghiniana lipozomlar Thylakoid lipidler ile gelen ekleme

Bu yöntem, fotosentez araştırmalarında, yakalanan ışık enerjisinin ve ışık toplama komplekslerinin solması, kinetiği ve transferin verimliliği gibi temel soruları anlamamıza yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, lipozomların, fotosentez sırasında iyon ve pH değişikliklerinin incelenmesine izin vererek, bir tilakoid zarın doğal durumuna benzeyen bir zar bölmesi sağlamasıdır. Protokole başlamak için, önceden hazırlanmış C.meneghiniana hücrelerini, 500 mililitrelik santrifüj şişeleri ile dört santigrat derecede önceden soğutulmuş bir rotorda 4, 300 kez G'de 15 dakika santrifüjleyin.

Hücre peletleri homojenizasyon tamponunu çalkalayarak ve pipetleyerek yeniden süspanse edin. Süspansiyonu tek bir uygun plastik tüpe aktarın ve son hacmi 12 mililitre ile sınırlayın. Ardından, boncuk değirmenini ve ekipmanı yaklaşık 60 dakika önceden soğutun.

50 mililitrelik kabı %75'e kadar bir cam boncuk karışımı ile doldurun ve hücre süspansiyonunu ekleyin. Bir spatula veya cam çubukla karıştırın ve gerekirse HB ekleyin. Hücre bozulması için, her darbe arasında 30 saniye soğutma olacak şekilde tam hızda yedi x 45 saniyelik darbeler kullanın.

Bozulan hücreleri bir cam filtre hunisi üzerinden süzün ve berrak görünene kadar HB'yi cam boncukların üzerine dökerek yıkayın. Ardından, yıkama fraksiyonunu süzüntü ile birleştirin ve son hacmi 150 mililitreden düşük tutun. Hücre kalıntılarını peletlemek için üç adet 50 mililitrelik plastik tüp kullanarak numuneyi 140 kez G'de 15 dakika santrifüjleyin.

Süpernatanı dikkatlice 20 mililitrelik polikarbonat ultrasantrifüj şişelerine aktarın ve peleti atın. Şişeleri HB ile doldurun. Ağırlığı dengeleyin. Tilakoid membranları peletlemek için 300, 000 kez G ve dört santigrat derecede bir saat boyunca uygun bir rotorda santrifüjleyin.

Membran peletini mümkün olduğunca az yıkama tamponu ile yeniden süspanse edin, küçük bir boyacı fırçası kullanarak. Polikarbonat ultrasantrifüj şişelerini yıkama tamponu ile doldurun. Ağırlıklarını dengeleyin.

Onları 200, 000 kez G ve dört santigrat derecede 20 dakika santrifüjleyin. Yıkanmış membranları boyacının fırçası ile tekrar süspanse edin. Tüm tilakoidleri 15 mililitrelik bir numune şişesinde toplayın.

Ultrasantrifüj tüplerini bir mililitrelik bir hacim için üste sükroz gradyan çözeltisi ile doldurun. Tüpleri tamamen donana kadar eksi 20 santigrat derecede dondurun. Ardından, tüplerin dört santigrat derecede çözülmesine izin verin.

Daha sonra, 125 mikrogram klorofile karşılık gelen numuneleri kullanın ve bunları B1 tamponu ile 0.9 mililitre hacme ayarlayın. Çözündürme için, 20 milimolar nihai konsantrasyona N.Dodesyl Beta D maltopiranosid ekleyin. Tüpü üç kez ters çevirin.

Köpük oluşumunu önlemek için hafifçe sallayarak 20 dakika boyunca buzun üzerine koyun. Dört santigrat derecede önceden soğutulmuş bir masa üstü santrifüjde 12.000 kez G'de beş dakika santrifüjleyin. Süpernatanı gradyan üzerine yükleyin ve 17 mililitrelik şişeler kullanılıyorsa, gradyan başına 125 mikrogramdan fazla toplam klorofil yüklemeyin.

100.000 kez G ve dört santigrat derecede 22 saat santrifüjleyin. İstenen kahverengi FCP fraksiyonlarını bir şırınga kullanarak gradyandan kurtarın. Hacmi tahmin edin.

Ardından, beş mikrolitrelik bir alikotu çıkarın ve 995 mikrolitre B1A ile seyreltin. Ardından, geri kazanılan numunenin hacmini beş mililitrelik bir pipetle ölçün. FCP komplekslerini, deterjan içermeyen B1 tamponu ile geri kazanılan hacmin iki katı ekleyerek yıkayın.

Numuneleri, 1.000 kez G'de 30 kilodaltonluk bir kesme ve en az 20'lik 672 nanometrede bir absorbansa dört santigrat derece ile bir membran yoğunlaştırıcıda konsantre edin. Sıvıları iki mililitrelik bir reaksiyon tüpüne pipetleyin ve hafif bir nitrojen akışı kullanarak kloroformu buharlaştırın ve lipitleri tüp tabanının tüm alanına yayın. Tüm çözücü buharlaşana kadar nitrojenin akmasına izin verin.

Lipid karışımını 29 mikrolitre N Oktil beta d glukopiranozitte dört saat boyunca dört santigrat derecede çözündürün. Lipid karışımını 30 santigrat derecede 10 dakika inkübe edin. Daha sonra, lipit karışımını bir sonikatör banyosunda 25 santigrat derecede üç kez üç dakika boyunca inkübe edin.

Karışımı her sonikasyon arasında 30 saniye boyunca buz üzerine yerleştirin. 221 mikrolitre trisin tamponu ve 250 mikrolitre dört katlı diyaliz tamponu ekleyin. 50-70 nanometre tanımlı bir lipozom çapı elde etmek için 0,1 mikron polikarbonat membranlı bir ekstrüder kullanın.

Ekstrüderi membran ve filtre desteği ile monte edin. Ekipmanı durulayın ve nemlendirin ve hava kabarcıklarını önlemek için dikkatli ve yavaş çalışın ve tertibatı iyice sıkın. Bir şırıngayı dört katlı diyaliz tamponu ile doldurun ve ikinci şırıngada kabarcık görülmeyene kadar ekstrüderi önceden ıslatın.

Lipid deterjan misellerini ekstrüdere uygulayın ve çözeltiyi bir şırıngadan diğerine ileri geri bastırın. Çözelti homojen görünene kadar bu adımı beş kez tekrarlayın. FCP komplekslerinin dahil edilmesine geçin ve toplam 500 mikrolitre B1A tamponu hacminde 20 mikrogram klorofil a'ya eşit FCP'yi, ekstrüde lipid misellerinin 250 mikrolitresine ve 250 mikrolitre dört kat DP'ye ekleyin. Numuneleri, her biri 25 santigrat derecede üç dakika boyunca 1.500-3.000 RPM'de bir termomikserde üç aralıkta inkübe edin, buz üzerinde 30 saniyelik bir duraklama ile kesintiye uğrayın.

Dört adet 1.5 mililitrelik reaksiyon tüpünün kapağını üst kısmın hemen altından kesin ve hala kapağa oturan bir halka verin. 1,5 x 1,5 santimetrelik diyaliz membranları hazırlayın ve bunları 20 mililitre tek katlı diyaliz tamponunda yıkayın. Her kapağı 250 mikrolitre numune ile doldurun.

Membranı dikkatlice kapağın üzerine yerleştirin, böylece bölme numune ile tamamen doldurulur ve hava kabarcığı oluşmaz. Bölme kapanacak şekilde tertibat üzerindeki reaksiyon tüpü halkasını sıkın. Numuneleri 50 mililitre tek katlı diyaliz tamponunda gece boyunca 12-16 saat boyunca yuvarlanan bir çalkalayıcı üzerinde buz üzerinde diyaliz edin.

Tamponu taze diyaliz tamponu ile değiştirin ve kalan deterjanları en az altı saat boyunca çıkarmak için yedi miligram adsorban boncuk ekleyin. Diyaliz tamponunu tekrar değiştirin ve numuneleri 12 saat daha diyalize edin. Diyaliz membranını 200 mikrolitrelik bir mikropipet ucu ile delerek lipozomları geri kazanın ve tüm lipozomları reaksiyon tüpü kapağından aspire edin.

FCP lipozomlarını en az iki mililitre 1X diyaliz tamponunda 1.5 saat boyunca 100.000 kez G ve dört santigrat derecede santrifüjleyin. Santrifüj tüpünü 45 derecelik bir açıyla çevirerek lipozomları geri kazanın. Lipozomların bir dakika aşağı hareket etmesine izin verin.

FCP lipozomlarını 25-50 mikrolitrelik son hacimde geri kazanın ve çökeltiyi rahatsız etmekten kaçının. Normalleştirilmiş absorbans spektrumlarındaki farklılıklar, karotenoidlerin emildiği 500 ila 550 nanometre arasındaki spektral bölgede meydana gelen pigment kaybını gösterir. Kompleksler hala işlevselse, benzer emisyon ve uyarma spektrumları ile gösterilirse pigment kaybı kabul edilebilir.

Lipozomlarda FCP'den kaynaklanan klorofil floresan verimi, FCP kümelerindeki eksitonik etkileşim nedeniyle azalır. Bir potasyum iyon gradyanının FCP floresan verimi üzerindeki etkisi, potasyum klorür eklenirse yüzde 30 oranında düşen standart tamponun varlığında test edildi. Potasyum gradyanı, FCP floresansını başlangıç seviyesine geri yükleyen ve FCP komplekslerinin in vivo potasyum iyonu konsantrasyon gradyanlarına yanıt verdiği hipotezini doğrulayan valinomisin tarafından salındı.

Bu prosedürü takiben, ışık enerjisi transferinde ek soruları incelemek için tamrazol floresansı, pompa probu ve tek molekül spektroskopisi gibi diğer yöntemler uygulanabilir.