Bioengineering
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Biologiske kompatibilitet profil på biologisk materiale for bein gjenfødelse
Summary November 16th, 2018
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Antall romanen biologisk materiale utviklet for å reparere store bein lesjoner er kontinuerlig utvide med sikte på å styrke bein healing og overvinne komplikasjoner knyttet bein transplantasjon. Her presenterer vi en tverrfaglig strategi for pre-klinisk biocompatibility testing av biologisk materiale for bein reparasjon.
Transcript
Disse metodene kan bidra til å svare på de viktigste spørsmålene innen biomaterialer. Spesielt for beinregenerering. De brukes til å evaluere effektiviteten av biomaterialer og potensielle immunresponser.
Den største fordelen med denne tverrfaglige plattformen er at den gir en rekke parametere for å forutsi biokompatibilitet av biomaterialer som brukes til beinreparasjon. Implikasjonene av disse in vitro- og in vivobeinteknikkene strekker seg mot andre beinlidelser. På grunn av behovet for preklinisk screening av nye ortopediske biomaterialer.
Den dermatologiske metodikken kan gi innsikt i biomaterialer for beinheling, den kan også brukes på biomateriale vurderinger for enhver annen klinisk indikasjon. Aspirere kulturmedium fra primære osteoblaster 14 dager etter tilsetning av osteogen mineraliseringsmedium. Skyll to ganger med 0,5 milliliter 1X PBS.
Deretter fikser cellene ved å legge til 0,5 milliliter med 10% bufret formalinløsning og inkubere ved romtemperatur i 10 minutter. Etter 10 minutter, aspirere 10% bufret formalin med en engangspipet og vask to ganger med 0,5 milliliter ultrapure vann. Tilsett deretter 250 mikroliter med 40 millimolar Alizarin Red S farging løsning til de faste osteoblastene.
Og inkuber platen ved romtemperatur i 10 minutter på en shaker ved 100 rister per minutt. Etter inkubasjonen med fargeløsning, aspirer fargingsløsningen med en engangspipetter og skyll med en milliliter ultrarent vann. Gjenta dette trinnet fem til 10 ganger til skylleløsningen kommer klart av for å fjerne uspesifikk farging.
Etter aspirering av den endelige vasken, legg til en milliliter kald PBS. Og inkuber platen ved romtemperatur i 10 minutter på en shaker som før. Deretter overfører du de beisede betatrikalciumfosfatskivene til en ny brønn og skanner platene med en planskanner for å registrere mineralisering.
Etter bildeopptak, legg til 250 mikroliter med 10% cetylpyridiniumkloridiumkloridiniumkloridoppløsning og rist i 15 minutter for å trekke ut Alizarin Red S-fargestoffet. Deretter overfører du løsningen fra brønnene til individuelle 1,5 ml rør og sentrifuge ved 17 000 x g i fem minutter ved romtemperatur. Fortynn ekstraktet med 10% cetylpyridiniumkloridiniumkloridiniumoppløsning ved en fortynningsrasjon på 1:10 til 1:20 i et 1,5 milliliter rør.
Overfør deretter 300 mikroliter av hver fortynnede prøve til brønnene på 96-brønnplaten. Inkluder to tomme brønner som bare inneholder 10% cetylpyridiniumkloridiumklorid. Deretter forbereder syv Alizarin Red S referansestandarder fra 4 400 mikromos ved å fortynne 40 milliomolar Alizarin Red S farging løsning med 10% cetylpyridinium klorid løsning for å generere en standard kurve.
Legg 300 mikroliter av hver standard inn i platen. Til slutt, les absorberende av prøver, blanks, og referanse standarder på 520 nanometer. Isoler benmargs osteoplast forløpere fra lårbenet og tibiae av en euthanized mus ved hjelp av steril saks for å fjerne bena fra kroppen på hofteleddet.
Klipp lemmer på kneet og ankelleddene og fjern det myke vevet med steril skalpell og tang. Klipp av epiphyses. Sett inn en 27 gauge nål festet til en sprøyte fylt med en milliliter benvekst medium inn i lumen og skyll ut margen i en seks centimeter steril Petri parabolen.
Etter å ha gjentatt dette for alle lårben og tibiae, overfør cellesuspensjonen til et 50 milliliter konisk rør. Vask seks centimeter Petriskål med fem milliliter beinvekstmedium og overfør den til samme 50 milliliter koniske rør. Sentrifuge på 350 x g ved fire grader Celsius i fem minutter.
Etter sentrifugering re-suspendere cellene i en milliliter per brønn av osteoklalast differensiering medium. En BALB/c-mus gir tilstrekkelig antall osteoklastforløpere for en 24-brønns kulturplate. Legg primære osteoblaster suspendert i beinvekstmedium på biomaterialet og kontrollene på 8,8 * 10 ^ 4 celler per kvadratcentimeter.
Beta trikalsiumfosfatskiver, kontrollert storfebein og vevskulturplast brukes her. Inkuber ved 37 grader celsius i fem prosent karbondioksid i 24 timer. Etter 24 timer, tilsett nyisolerte benmargs osteoklast forløpere og osteoklakk differensiering medium til de kultiverte primære osteoblaster og gå tilbake til inkubatoren i fem dager med kultur på 37 grader celsius på fem prosent karbondioksid.
Erstatt mediet med nylaget osteoklaster differensieringsmedium annenhver dag. Deretter flekker osteoklaster for tartratresistent syrefosfatase for å evaluere differensiering. Barber hodebunnen av en bedøvet åtte uker gammel BALB/c-mus og rengjør overflaten med 7,5 % povidonjodoppløsning og 70 % etanol.
Dekk øynene med oftalmisk salve for å forhindre tørking under prosedyren. Sikre et passende nivå av anestesi ved mangel på en reaksjon på en tå og haleklem. Deretter etter å ha gjort en midline sagittal snitt fjerne paracranium bindevev over høyre parietal bein ved å skrape den med en skalpell.
Bruk deretter en steril tanntrephine med en diameter på fire millimeter ved 2000 rotasjoner per minutt for å skape en kritisk størrelse defekt i høyre parietal bein. Stadig vanne regionen med steril saltvann løsning mens notching riktig parietal bein og kutte gjennom ektokortext og noen endocortex. For å unngå skade på Dera Mater, bruk en liten periosteal heis for å bryte gjennom de resterende endocortex.
Bruk deretter tang til å løfte calvarialbenet forsiktig og fjerne det. Den resulterende feilen skal være sirkulær og ca. 3,5 millimeter i diameter. Fyll deretter kalkfeilen med beta trikalsiumfosfat kollagenskum, presodert i steril PBS.
For å holde biomaterialet på plass, bruk 0,5 mikroliter vevslim på slutten av defekten på to motsatte punkter. Lukk deretter huden med en ikke-absorberbar sutur. Plasser en bedøvet mus på ryggen, barber bukpelsen og rengjør den barberte overflaten med 7,5% povidone jodløsning og 70% etanol.
Etter å ha gjort en åtte millimeter lang midline snitt gjennom huden langs linea alba av magen, implantat PBS gjennomvåt biomateriale under huden. Deretter suturere huden med en ikke-absorberbar sutur. Åtte uker etter implantasjon, forbruker implantasjonsstedet med omkringliggende vev fra eutanisert mus.
Dette bildet viser at veksten på beta tricalcium fosfat plater vist i åpne barer ikke påvirker osteoblast levedyktighet sammenlignet med vekst på vev kultur plast på syv og 14 dager med kultur. Kultiverte osteoblaster ble farget med Alizarin Red S etter 14 dager. Mineraliseringen var høyere for mineraliseringsmediekontroller sammenlignet med osteoblaster dyrket i middels alene.
Og på beta tricalcium fosfat plater i suspensjon kultur brønner. Når en kirurgisk indusert kritisk størrelse calvarial defekt ble stående tom, ble et tynt lag som dekker hele feilen observert, men ingen signifikant beindannelse var til stede ved 12 uker etter operasjonen. I motsetning, når feilen inneholdt beta tricalcium fosfat kollagen skum, skum rester omgitt av tett fibrøst vev inkludert noen blodkar og inflammatoriske celler brode defektområdet uten tegn på beindannelse.
Etter subkutan beta trikalsfat kolsfat kollagen skum implantasjon, en inflammatorisk respons med fremmedlegeme gigantiske celler ble observert på hematoksylin og Eosin-farget seksjoner et tegn på fibrose på Massons trichrome farget seksjoner på åtte uker. I motsetning hadde implantasjonsstedet for sham-kontrollene minimal betennelse og ingen fibrose. Mens du prøver denne prosedyren er det viktig å gjøre presis og reproduserbar notering av golgata uten å skade dyret.
Etter denne prosedyrens andre metoder som osteoklast differensieringsanalyser og høy gjennomstrømning til peritoneale immunmodeller kan forhåndsformes for å svare på flere spørsmål som osteoklasters respons på biomaterialer og type immunrespons.
Please enter your institutional email to check if you have access to this content
has access to
BackLogin to access JoVE
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
To receive a free trial, please fill out the form below.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You
Thank You
Thank You
