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이 프로토콜 추출 및 C. arabica L.의 셀 정지에 카페인의 정량화에 대 한 효율적인 방법론과 식 수준으로 카페인 synthase의 효소 활동을 평가 하기 위한 실험 과정에 설명 합니다. 이 효소를 인코딩하는 유전자.
이 방법은 분석 화학, 생화학 및 생명 공학 분야의 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 카페인 생합성에서 발생하는 변화는 무엇입니까. 이 기술의 주요 장점은 카페인을 생산하는 인비트로 식물 모델에 적용 될 수 있다는 것입니다.
시작하려면, lyophilized 세포에 아세톤의 10 밀리리터를 추가하고 30 초 동안 소용돌이 믹서와 혼합하기 전에 플라스크를 밀봉. 그런 다음 100 rpm에서 실온에서 5 시간 동안 회전기와 샘플을 혼합합니다. 그 후, 아세톤의 25 마이크로리터로 샘플을 다시 중단한다.
먼저 이전에 준비된 카페인 추출물의 마이크로리터 1개를 실리카 젤 플레이트에 바부합니다. 이어서, 발동상, 사이클로헥산 아세톤의 10밀리리터를 가진 크로마토그래피 챔버에서 TLC를 개발한다. 컴팩트한 UV 램프로 짧은 파장 자외선으로 카페인 밴드를 시각화합니다.
그 후, 273 나노미터에서 밀도에 의해 카페인 수준을 정량화. 필터 용지를 사용하여 이전에 준비된 셀 서스펜션을 진공 필터로 사용합니다. 이어서, 도자기 박격포를 사용하여 액체 질소 및 RNA 격리 시약으로 세포 샘플을 균질화할 때까지 메이케레이트한다.
다음으로, 시료의 500마이크로리터를 멸균 마이크로 원심분리기 튜브로 이송한다. 그런 다음 클로로폼 이소아밀 알코올 300 마이크로리터와 평형 페놀의 마이크로리터 300을 추가합니다. 샘플을 섭류 믹서와 원심분리기와 혼합하여 섭씨 4도에서 15분간 20, 000G로 섞습니다.
그 후, 상부상 마이크로리터 300마이크로리터를 깨끗한 마이크로 원심분리기 튜브로 이송한다. 그런 다음 200 마이크로리터의 이소프로판올을 추가하고 음의 섭씨 20도에서 1 시간 동안 튜브를 배양합니다. 펠릿에 에탄올 1밀리리터를 넣습니다.
이어서, 12, 000G에서 튜브를 원심분리하고 10분 동안 액체 상을 감소시한다. 다음으로 실온에서 1.5시간 동안 시료를 건조시합니다. 이어서, DEPC 처리된 물의 25마이크로리터로 RNA 추출물을 다시 중단한다.
먼저 멸균 마이크로 원심분리기 튜브에 총 RNA 추출물 2마이크로그램을 추가합니다. 그런 다음 10X 반응 버퍼의 마이크로리터 1개와 DNase의 마이크로리터 1개를 추가합니다. DEPC 처리 된 물로 10 마이크로 리터에 반응의 최종 볼륨을 가져옵니다.
그런 다음 시료와 원심분리기를 2, 000G에서 1분간 섞는다. 다음으로 샘플을 섭씨 37도에서 30분간 배양합니다. 그 후, 50 마이크로몰라 디소이소르 에틸렌 디아민 테트라아세테이트의 1개의 마이크로리터를 추가하여 반응을 중단합니다.
샘플을 섭씨 65도에서 10분간 배양합니다. 그런 다음 아가로즈 젤에 100 나노그램의 RNA를 적용하고 젤을 실행합니다. 젤 사진 문서화 시스템을 사용하여 RNA의 무결성을 시각화합니다.
첫째, 마이크로 원심분리기 튜브에 총 RNA 2.5 마이크로그램을 추가합니다. 그런 다음 올리고 데옥시티미드 프라이머의 마이크로리터 1개를 추가하고 뉴클레아제 없는 물로 13마이크로리터의 최종 부피에 튜브를 채웁니다. 샘플을 혼합하고 원심분리기를 2, 000G에서 1분간 섞습니다.
샘플을 섭씨 65도에서 5분간 배양합니다. 그리고 2 분 동안 섭씨 4도에서. 다음으로, 5X 반응 버퍼의 4개의 마이크로리터, dNTP 믹스의 2개의 마이크로리터 및 시료에 역 전사제 1개를 추가합니다.
그런 다음 샘플을 2, 000G에서 1분 동안 부드럽게 섞습니다. 그 후 샘플을 섭씨 45도에서 50분간 배양한 다음 섭씨 70도에서 10분간 배양합니다. PCR 마이크로 원심분리기 튜브에 2X Taq DNA 폴리머라제 7.5 마이크로리터와 RAX 0.1 마이크로몰레를 추가합니다.
그런 다음 CCS1 유전자를 증폭시키기 위해 각각 0.75 마이크로리터를 앞뒤로 프라이머를 첨가합니다. 이 후, 추가 600 CDNA 템플릿의 나노 그램. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 실시간으로 증폭 반응을 preform.
그런 다음 PCR 소프트웨어로 데이터를 분석합니다. 셀룰러 재료 1 그램을 계량하고 알루미늄 호일에 포장하십시오. 샘플을 추출한 후 유리 바이알로 옮기고 2.5 밀리리터의 추출 버퍼를 추가합니다.
다음으로, 샘플을 섭씨 4도에서 20분 동안 20, 000G에서 원심분리합니다. 500 개의 마이크로 리터 알리쿼트를 극저온 바이알로 옮기. 분광광계를 사용하여, 소 세릭 알부민을 표준으로 사용하여 562 나노미터에서 시료의 단백질 농도를 측정합니다.
먼저, 텍스트 프로토콜에 따라 마이크로 원심분리기 튜브에서 반응 혼합물을 준비한다. 그런 다음 총 부피를 100 밀리머 트리 HCL로 200 마이크로리터로 늘립니다. 방사성 물질과의 반응 혼합물을 준비하는 동안 자신의 안전이 적절한 예방 조치를 따르는 것이 필수적이라는 것을 기억하십시오.
마이크로 원심 분리기 튜브를 얼음에 보관하고 7~9밀리그램의 단백질을 함유한 수용성 분획의 양을 추가합니다. 그런 다음 혼합물을 소용돌이쳐 30°C에서 30분 동안 배양합니다. 그 후 샘플을 11, 000G에서 5분간 원심분리합니다.
이어서, 900 마이크로리터의 부피를 조심스럽게 회수하고, 샘플을 신자극 병으로 옮는다. 다음으로, 실온에서 후드의 건조를 완료하기 위해 클로로폼을 증발시다. 바이알에 5밀리리터의 신경유를 추가합니다.
마지막으로, 신경화 카운터를 사용하여 카페인에 통합된 방사능을 분석합니다. 이 프로토콜에서, 카페인에 대한 흡광도의 패턴은 TLC 밀도를 통해, 가시광 스펙트럼을 통해, 273 나노미터에서 최대 흡수로 판독되었다. TLC 플레이트에 카페인의 분리 곡선은 0.34에서 0.39 사이의 RF를 보였다.
중단된 세포에서 유래된 RNA는 28s, 18s 및 5s RRNA 서브유닛의 명확한 분리를 나타내며, 이는 샘플이 고품질임을 나타낸다. 마지막으로, 카페인 신체 유전자에 대한 단일 증폭 생성물을 보여주는 QPCR 분석에서 용융 곡선을 얻었다. 개발 후, 이 기술은 커피, 차 및 코코에서 이차 대사 조직 문화를 탐구하는 생명 공학 및 생화학 분야의 연구자들이 길을 열었습니다.
방사능 및 분자 병리학을 다루는 것은 매우 위험할 수 있으며, 방사성 물질에 대한 장갑, 고글 및 특수 장비의 사용과 같은 예방 조치는 이 절차를 수행 할 때 항상 취해야합니다.
