Biochemistry
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Beredning av cellcykeln svängningar i mikroemulsioner av cellfria Xenopus ägg extrakt
Summary September 27th, 2018
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Vi presenterar en metod för generering av in vitro- självbärande mitotiska svängningar på enskild cell nivå genom att kapsla in ägg extrakt av Xenopus laevis i vatten-i-olja mikroemulsioner.
Transcript
Denna metod kan hjälpa till att besvara viktiga frågor inom systembiologiområdet, såsom den reglerande mekanismen bakom det mitotiska nätverket och cellcykelklockans dynamiska egenskaper och funktioner. Den största fördelen med denna teknik är att det kommer att generera en stor mängd droppar med flera cellcykler i varje, vilket ger oss en hög genomströmning ram för kvantitativ manipulation och analys. Till att börja kasta partier av ägg som har oklara gränser mellan djur och vegetal stolpar eller oregelbundna vita fläckar ovanpå djurstänger.
Välj därefter en lämplig sats ägg från en kvinnlig groda och överför äggen till en 600-milliliter bägare. Häll ut ett överskott av 0.2x MMR buffert, och försiktigt lägga cystein i 1x extrakt buffert till äggen. Efter detta, skaka bägaren kraftigt för hand för att ta bort gelé rockar av äggen.
Upprepa denna tvätt tre gånger med totalt 800 milliliter cysteinbuffert eller tills äggen aggregerar och lägger sig i botten av bägaren. Efter gelé pälsen tas bort, tvätta äggen fyra gånger i en liter 0,2 x MMR lösning. Använd en glaspipett för att plocka upp och kasta äggen som blir vita.
Häll MMR-bufferten ur bägaren och tillsätt 200 milliliter kalciumjonoforlösning i äggen. Använd en glaspipett för att röra äggen försiktigt tills de aktiveras, och ta bort kalciumjonofalösningen. Lämnar äggen i kalciumjonoforlösning för länge kommer att inleda apoptos.
Vi rör äggen i 1,5 minuter och kontrollerar aktiveringseffektiviteten. Om de inte aktiveras, återuppta omrörning, och kontrollera oftare tills 90%aktivering uppnås. Efter äggen bosätta sig i botten av bägaren, kontrollera aktiveringen effektivitet.
Välaktiverade ägg har cirka 25%av djurpolen och 75%av vegetal polen. Därefter tvätta äggen två gånger med en total volym på 50 milliliter extraktbuffert kompletterat med proteashämmare. Sedan, försiktigt överföra äggen till en 0,4-milliliter snap-cap microtube.
Centrifugera mikroröret i 60 sekunder vid 200 g och sedan vid 600 g i 30 sekunder för att packa äggen. Använd sedan en pasteurpipett av glas för att ta bort överskottsbufferten ovanpå äggen efter varje steg. Efter detta, krossa äggen vid 15, 000 g i 10 minuter vid fyra grader Celsius.
Använd ett rakblad för att skära rören för att separera de tre skikten av krossade ägg och hålla rå cytoplasma i mellanskiktet. Sedan överföra rå cytoplasma till rena ultracentrifugrör. Komplettera cytoplasman med proteashämmare och cytochalasin B vid 10 mikrogram per milliliter vardera.
Centrifugera den råa cytoplasman vid 15, 000 g och fyra grader Celsius i fem minuter. Använd sedan ett rakblad för att skära röret och hålla cytoplasman i mellanskiktet. Placera de nyberedda extrakten på is.
Lägg först till Securin-mCherry mRNA till de beredda extrakten. Därefter lägger du till 200 mikroliter av 2%PFPE-PEG fluorsurfaktant till extraktet mRNA-blandningen. Använd en vortex mixer för att generera droppar, justera virvelhastighet och varaktighet efter behov.
Sedan, inspektera visuellt dropparna för att säkerställa att de är enhetliga i storlek. Med hjälp av en 200-mikroliterpipett överför du dropparna som flyter ovanpå och en lika stor volym ytaktivt vatten till ett PCR-rör. Doppa ett glasrör i droppskiktet, och vänta tills dropparna fyller ungefär 75%av röret.
Tryck sedan in röret i det ytaktiva lagret och fyll röret helt. Fyll därefter en glasbottnad maträtt med mineralolja. Använd sedan finpincett för att sänka ner droppfyllda röret i oljan.
Använd en glaspipett för att ta bort eventuellt synligt skräp eller läckta droppar. För att undvika förflyttning och läckage av droppar bör glasröret fyllt med droppar sänkas ned under mineralolja försiktigt. Vi kan antingen driva röret på båda ändarna med balans eller tillsätt några droppar mineralolja på ändarna av röret samtidigt först.
Efter detta, använd ett epifluorescens mikroskop utrustad med en motoriserad xy-stadiet för att avbilda dropparna. Record time-lapse videor i det ljusa fältet och flera fluorescens kanaler var sjätte till nio minuter tills dropparna förlorar sin verksamhet. Med hjälp av detta protokoll producerades mitotiska svängning i både enkla, kärnfria celler och komplicerade celler med atomkärnor.
De kärnorfria dropparna genererade mitotisk svängning upp till 30 undamped cykler under 92 timmar. Mitotiska oscillatorns förmåga att köra nedströms mitotiska händelser undersöktes också. Den självihållande mitotiska oscillator körde förändringar av nukleärmorfologi observeras genom den autonoma förändringen av distinkta cell-cykel faser.
Medan du försöker detta förfarande, Det är viktigt att komma ihåg den tid när du gör extraktet, eftersom det är tidskänsliga, och alltid hålla ägg och extrakt på is. Efter dess utveckling banade denna teknik vägen för forskare inom systembiologi att utforska grundläggande principer för komplexa klockegenskaper, som tunbarhet och stokastik i Xenopus laevis.
Please enter your institutional email to check if you have access to this content
has access to
BackLogin to access JoVE
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
To receive a free trial, please fill out the form below.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You
Thank You
Thank You
CH
DE