Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Beredning av cellcykeln svängningar i mikroemulsioner av cellfria Xenopus ägg extrakt

Published: September 27, 2018 doi: 10.3791/58240
Automatic Translation
1,2, 1, 2, 3, 1,4
1Department of Biophysics, University of Michigan, Ann Arbor, 2Department of Chemistry, University of Michigan, Ann Arbor, 3Department of Computer Science, Wayne State University, 4Department of Physics, University of Michigan, Ann Arbor

Summary

Vi presenterar en metod för generering av in vitro- självbärande mitotiska svängningar på enskild cell nivå genom att kapsla in ägg extrakt av Xenopus laevis i vatten-i-olja mikroemulsioner.

Abstract

Realtid mätning av svängningar på enskild cell nivå är viktigt att avslöja mekanismerna av biologiska klockor. Även bulk extrakt beredd från Xenopus laevis ägg varit kraftfull i dissekera biokemiska nätverk bakom Cellcykelprogression, leder deras ensemble genomsnittliga mätning vanligtvis till en dämpad svängning, trots alla enskilda oscillator är ihållande. Detta beror på svårigheten att perfekt synkronisering bland enskilda oscillatorer i bullriga biologiska system. För att hämta encelliga dynamiken i oscillatorn, utvecklat vi ett droplet-baserade konstgjorda cellsystem som kan rekonstruera mitotiska cykler i cell-liknande fack encapsulating cykling cytoplasmiska extrakt av Xenopus laevis ägg. Dessa enkla endast cytoplasmiska celler uppvisar ihållande svängningar för över 30 cykler. För att bygga mer komplicerade celler med kärnor, vi lagt till demembranated spermier kromatin för att utlösa atomkärnor självmontering i systemet. Vi observerade en periodisk progression av kromosom kondens/decondensation och atomkärnor omsluta uppdelning/reformationen, som i riktiga celler. Detta indikerar att den mitotiska oscillatorn fungerar troget för att driva flera nedströms mitotiska händelser. Vi spårade samtidigt dynamiken i den mitotiska oscillator och nedströmsprocesser i enskilda droppar med flerkanaligt time-lapse fluorescensmikroskopi. Konstgjorda cellcykeln-systemet ger en hög genomströmning ram för kvantitativa manipulation och analys av mitotiska svängningar med encelliga upplösning, vilket sannolikt ger viktiga insikter i de föreskrivande maskiner och funktioner av klockan.

Introduction

Cytoplasmiska extrakt beredd från Xenopus laevis ägg representerar en av de mest dominerande modellerna för biokemiska studier av cell cykler, med tanke på den stora volymen av oocyter, den snabba Cellcykelprogression och förmåga beredning mitotiska händelser in vitro-1,2. Detta system har tillåtit första upptäckten och mekanistiska karakterisering av väsentliga cellcykeln-regulatorer som mognad-främjande faktor (MPF) samt nedströms mitotiska processer inklusive spindel montering och kromosom segregation1 ,2,3,4,5,6,7,8,9,10, 11. Xenopus ägg extrakt har också använts för detaljerad dissektion av de regulatoriska nätverk av cellcykeln klockan8,12,13,14 och för studier av de DNA-skadan /Replication checkpoint15 och den mitotiska spindel montering checkpoint16,17,18.

Dessa studier av cell cykler med Xenopus ägg extrakt har främst baserats på bulk mätningar. Konventionella bulk reaktion analyser kan dock inte efterlikna verkliga cellen beteenden, ges en större diskrepans i sina mått och subcellulär rumslig uppdelning av reaktion molekyler. Dessutom är bulk mätningar av mitotiska aktiviteter benägna att ge ett begränsat antal cykler innan snabbt dämpning8. Dessa nackdelar av bulk reaktioner har förhindrat extrakt systemet för att ge ytterligare förståelse av komplexa klocka dynamiska egenskaper och funktioner. Nyligen genomförda studier har inkapslade cellfria cytostatika faktor-greps (CSF) Xenopus extrakt19,20 i storlek-definierad cell-liknande fack, vilket har bidragit till att belysa hur spindeln storlek moduleras av den cytoplasmiska volym. Men detta in vitro -system anhålls på metafas av meios II av cytostatika faktor1och behövs ett system som är kapabel av långsiktigt hållbar svängningar på enskild cell nivå för vidare utredning av cellcykeln oscillator.

För att studera cellcykeln svängningar med encelliga upplösning, har vi utvecklat en cell-skala, hög genomströmning system för beredning och samtidig mätning av flera självbärande mitotiska oscillerande processer i enskilda mikroemulsion droppar. I detta detaljerad video protokoll visar vi skapandet av konstgjorda mitotiska svängning systemet genom att kapsla in cykling Xenopus laevis ägg cytoplasman i mikroemulsioner i storlekar från 10 till 300 µm. I det här systemet var mitotiska svängningar inklusive kromosom kondens och avinstallation kondens, nuclear envelope uppdelning och reformationen, och nedbrytning och syntes av Anaphasen substrat (t.ex. securin-mCherry i detta protokoll) framgångsrikt ombildade.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla metoderna som beskrivs här har godkänts av den institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC) från University of Michigan.

1. beredning av material för cellcykeln beredning och upptäckt

  1. Gibson församlingen kloning för plasmid DNA konstruktion och mRNA rening av securin-mCherry
    1. Förbered tre DNA-fragment med pMTB2 vector ryggraden, securin och mCherry genom polymeras-kedjereaktion (PCR) och gel rening21,22.
    2. Mätning av koncentrationerna av fragment med hjälp av en fluorospectrometer. Kombinera 100 ng av stamnät med securin och mCherry skär på 1: molekylär förhållandet 1:1 och Tillsätt avjoniserat vatten för att justera den totala volymen av reaktion på 5 µL.
    3. Förbereda 6 mL 5 x isotermiska församlingen reaktion buffert med 3 mL 1 M Tris-HCl (pH 7,5), 300 µL av 1 M MgCl2600 µL 10 mM dNTP, 300 µL av 1 M DTT, 1,5 g PEG-8000 och 20 mg NAD23.
    4. Lägg till kombinerade fragment till en 15 µL av 1 x isotermiska församlingen reaktion buffert alikvotens. Inkubera reaktionen i en PCR-reaktionsröret vid 50 ° C i 15 minuter.
    5. Göra en 0,8% agaros gel och kör med en spänning på 10 V/cm att verifiera glödgning effektiviteten av dessa fragment.
    6. Rena Byggyta plasmiden och eluera med 15 µL RNase-gratis vatten. Omvandla 1 µL av den renade plasmiden DNA till 50 µL av DH5α behöriga E. coli celler24 för framtida bruk.
    7. Extrahera och rena plasmiden DNA av securin-mCherry från den DH5α behöriga E. coli celler.
    8. Transkribera den linearized securin-mCherry plasmiden DNA till mRNA och rena mRNA. Använda en spektrofotometer för att verifiera att koncentrationen av mRNA är mer än 100 ng/µL och förhållandet mellan absorbansen vid 260 nm och 280 nm är ca 2.0.
  2. Beredning av demembranated Xenopus laevis spermier DNA
    Obs: Anpassad från Murray 19911.
    1. Avliva vuxna manliga Xenopus laevis25 och dissekera testiklarna från fyra manliga grodor26,27.
    2. Placera testiklarna från fyra grodor i samma 100 mL petriskål. Skölj testiklarna tre gånger i 50 mL kall 1 x MMR lösning (0.1 M NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 5 mM HEPES, 0,1 mM EDTA).
    3. Ta bort överflödigt blod och fett från testiklarna i en 100 mL petriskål och sedan tvätta två gånger i kallt nukleära förberedelse buffert (NPB) (250 mM sackaros, 15 mM HEPES, pH 7,4, 1 mM EDTA, pH 8,0, 0,5 mM spermidine trihydrochloride, 0,2 mM spermine tetrahydrochloride).
    4. Ta bort kärn förberedelse bufferten (NPB) och skär testiklarna i bitar med längder mindre än 0.2 cm med vass dissekera sax i en 100 mL petriskål. Tillsätt 8 mL kall NPB till testiklarna för ytterligare uppdelning.
    5. Använda nylon mesh tyger med en porstorlek på 70 µm filter testiklarna och samla sperma prov i en 15 mL koniska rör. Snurra ner insamlade spermierna vid 1.730 x g i 10 minuter vid 4 ° C och ta bort supernatanten.
    6. Levererar spermacellerna med 1 mL NPB och 50 µL av 10 mg/mL lysolecithin och odla i rumstemperatur i 5 min till demembranate spermier.
    7. Tvätta demembranated spermier DNA med 10 mL kall NPB med 3% BSA lösning tre gånger.
    8. Mäta tätheten av spermier DNA med en hemocytometer.
    9. Frysa spermier DNA i 5 µL alikvoter i flytande kväve och lagra vid-80 ° C. Den optimala koncentrationen av spermier DNA är ca 105 kärnor/µL.
  3. Protein rening av GFP-nukleära lokalisering Signal (GFP-NLS)
    1. Förvandla BL21 GST-taggade GFP-NLS plasmiden (DE3) behöriga E. coli celler5.
    2. Inkubera cellerna utan antibiotika vid 37 ° C i 1 h och sedan spred sig på en LB agar tallrik med 100 µg/mL ampicillin.
    3. Inkubera plattan vid 37 ° C för 14 till 18 timmar att odla cellerna till enstaka kolonier. Plocka och Inokulera enstaka kolonier i 4 mL LB medier med 100 µg/mL ampicillin. Skaka cellerna vid 37 ° C i 12 timmar.
    4. Förbered Ånghärdad YT (Bacto-trypton 16 g, 10 g Bacto-jästextrakt, 5 g NaCl) och värma YT media till 37 ° C.
    5. Inokulera 1 mL av övernattning ruvade cellerna i LB media in i 250 mL förvärmd YT media med 100 µg/mL ampicillin och skaka i 2 timmar för att öka cell densiteten.
    6. Mäta cellen optiska densitet (OD) varje 30 minuter, med en spektrofotometer vid en våglängd på 600 nm. Lägg 0,1 mM IPTG in cellerna att inducera GFP-NLS proteinuttryck när det OD-värdet når 0,1.
    7. Skaka cellerna vid 18 ° C över natten att minska cell tillväxttakt och låta bättre proteinuttryck och syntes.
    8. Snurra ner cellerna vid 34,524 x g vid 4 ° C i 5 minuter och ta bort supernatanten.
    9. Återsuspendera cell pellets i 40 mL PBS-bufferten (levereras med 800 µL av 50 mg/mL lysozym, 100 µL av 0,2 M PMSF, 13,2 µL av en 10 mg/mL blandning av leupeptin, pepstatin och chymostatin och 8 µL 0,5 M EDTA) och inkubera vid 4 ° C i 20 minuter.
    10. Bryta ner celler med en någon sonikator på en frekvens av 20 kHz för 4 x 30 s, med 30 s mellanrum mellan varje ultraljudsbehandling, att släppa uttryckt GFP-NLS protein.
    11. Snurra på 20 000 x g i 35 minuter att ta bort de trasiga cellerna.
    12. Använd affinitetskromatografi att extrahera och rena GFP-NLS protein.
    13. Tvätta 1,5 mL pärla slammet tre gånger med 15 mL PBS-bufferten och inkubera 250 mL lysat med pärlor i 4 timmar vid 4 ° C med inversion.
    14. Snurra ner pärlorna vid 2000 x g i 5 min och tillsätt 10 mL tvättlösning (25 mM Tris base, pH 7.5, 500 mM NaCl, och 5 mM DTT) till pärlor. Inkubera pärlor i 700 µL eluering buffert (50 mM Tris-HCl, pH 8,8, 20 mM reducerad glutation och 5 mM DTT) med rotation vid 4 ° C. Samla en alikvot av elueringen med en volym på 50 µL.
    15. Mätning av koncentrationen av insamlade protein genom att köra en Coomassie blå gel28.
    16. Eluera de proteiner med PD-10 kolumner med 3 mL lagring buffert (20 mM HEPES, 150 mM KCl, 10% glycerol, pH 7,7) genom buffert utbyte.

2. beredning av cykling Xenopus extrakt

Obs: Det övergripande förfarandet förbereda extrakten illustreras i figur 1A. Anpassad från Murray 19911.

  1. Injicera tre mogna kvinnliga Xenopus laevis 66 IU gravid mare serum gonadotropin (PMSG) 10 dagar innan lägga ägg.
  2. Injicera dessa Xenopus grodor med 500 IE av humant koriongonadotropin (HCG) inducera ägg om 18 timmar före utarbetandet av cykling extrakt.
  3. Kassera lagda ägg över natten. Baserat på experiment (inga data anges), generera extrakt som framställts av färskpressad äggen längre aktiviteter än extrakt som framställts av lagda ägg från samma kvinnliga grodan. Pressa in ägg av varje kvinnliga grodan i 100 mm petriskålar innehållande 10 mL 0,2 x MMR buffert och inspektera i stereo Mikroskop.
  4. Kassera partier av ägg som har oklara gränser mellan djur och vegetal polacker eller har oregelbundna vita fläckar ovanpå djur polacker.
  5. Välj batchen av ägg från en kvinnlig groda presentera en homogen population av ägg med klart åtskilda djur och vegetal polacker och överföra äggen i en 600 mL bägare.
  6. Häll ut överflödigt 0,2 x MMR buffert och varsamt Tillsätt 250 mL på 2 g per 100 mL cystein (pH 7,7) i 1 x Extrahera buffert (100 mM KCl, 0,1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 50 mM sackaros, pH 7,7) till ägg.
  7. Skaka äggen kraftigt för hand och ta bort gelé rockera av ägg över tre tvättar med en total volym på 800 mL cystein buffert i 3 minuter eller tills ägg samlade och bosätta sig på botten av bägaren, som anger att gelé coat borttagning är framgångsrika.
  8. Tvätta ägg med 1 L 0,2 x MMR lösning över fyra gånger.
  9. Plocka och kassera ägg som blir vita med glas överföring pipett.
  10. Häll ut MMR bufferten och leverera ägg med 200 mL av 0,1 µg/mL kalcium jonofor A23187 lösning i 0,2 x MMR buffert för aktivering.
  11. Använd den breda öppning sidan av glas pipett för att röra äggen försiktigt tills äggen är aktiverat och tar bort kalcium jonofor lösning.
  12. Kontrollera aktivering effektivitet efter ägg bosätta sig på botten av bägaren. Väl aktiverat ägg har cirka 25% av djur pole och 75% av vegetal stången.
  13. Tvätta de aktiverade ägg två gånger med 50 mL 1 x extrakt buffert kompletteras med proteashämmare (10 µg/mL varje leupeptin, pepstatin och chymostatin).
  14. Noggrant överföra ägg till en 0,4 mL snapin-cap mikrorör och packa sedan ägg genom centrifugering vid 200 x g i 60 sekunder och sedan 600 x g i 30 sekunder.
  15. Ta bort extra buffert på toppen av ägg med ett glas Pasteur-pipett för att minska utspädningen av extrakt.
  16. Krossa ägg vid 15 000 x g i 10 minuter vid 4 ° C.
  17. Skär rören med ett rakblad att separera tre lager av krossade ägg och hålla rå cytoplasman mellanlagret.
  18. Överföra rå cytoplasman in nya ultracentrifugen rören och komplettera med proteashämmare och cytochalasin B på 10 µg/mL vardera.
  19. Centrifugera rå cytoplasman igen vid 15 000 x g vid 4° C i 5 minuter för att ytterligare rena cytoplasman genom att avlägsna överflödigt fett och äggula.
  20. Hålla nylagade extrakt på is.

3. droplet Generation

  1. 2D glas kammaren beredning
    Obs: De rektangel glasrör fungera som chambers som begränsar droppar i en enda 2-dimensionella planet, vilket möjliggör enklare observation och datainsamling.
    1. Skuren rektangel glasrör med en inre dimension 2 mm x 100 µm i 4 mm långa bitar. Använda den skarpa kanten av ett bryne, markera de önskade gränserna på den yttre ytan av glasröret med ljus etsningar och sedan Applicera försiktigt tryck på båda sidor av etsningar att bryta bitar av glasrör.
    2. Pre-Värm en torr bad inkubator till 95 ° C. Ta ut värmeblocket och placera det i polykarbonat vakuum exsickator.
    3. Placera ett 1,5 mL mikrocentrifug rör innehållande 30 µL av triklor (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silan i värmeblocket. Låg skära glas rören inuti den vakuum exsickatorn på ca 5 cm till värmeblocket.
    4. Anslut exsickatorn till en vakuumpump. Slå på pumpen i 1 minut att nå önskad vakuum nivå och sedan stänga 3-vägs ventilen för att försegla exsickatorn och låt triklor (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silan dunsten bestryka den inre väggen av glasrör. Detta kommer att skapa en hydrofoba miljö för att stabilisera droppar.
    5. Lämna glasrör inne exsickatorn för övernattning beläggning. Rören kommer att vara redo för nästa dag.
  2. Droplet generation och imaging
    Obs: Förfarandena för generera droppar och imaging illustreras i figurerna 1B och 1C.
    1. Leverera extrakt som bereddes i steg 2 med 10 ng/µL securin-mCherry mRNA för enkel endast cytoplasmiska cellcykeln experiment. Alternativt leverans extrakt med demembranated spermier kromatin (250 per µL av extraktet), 10 µM GFP-NLS protein och 10 ng/µL securin-mCherry mRNA att skapa droppar uppvisar periodiska atomkärnor morfologi ändras.
    2. I ett 1,5 mL mikrocentrifug rör levereras mix 20 µL av extraktet med rekombinant protein eller mRNA med 200 µL 2% framställa-polyetylenglykol (PFPE-PEG) fluorosurfactant i HFE7500 fluorerade olja.
    3. Generera små droppar med hjälp av en vortex mixer. Spänna av droplet storlekar kan moduleras av vortex hastighet och längd. För att skapa droppar med radier som sträcker sig från 50 till 200 µm, ställa in vortex hastigheten vid 56 x g (3200 rpm med en radie på 4,9 mm) och tryck försiktigt av mikrocentrifug rör som innehåller extraktet och tensid blandningen på mixern för 3,5 sekunder. Inspektera visuellt om droppar är enhetliga i storlek.
    4. Använda 20 µL pipett för att överföra droppar flytande på toppen och en lika stor volym av PFPE-PEG tensid i en PCR-röret. Doppa glasröret beredd från steg i droplet skiktet i 1,5 mL mikrocentrifug rör och vänta tills droppar har fyllt ungefär 75% av röret, sedan tryck röret i tensid lagret tills röret fylls helt. Detta sänker droplet tätheten och tillåta droppar bildar ett enda skikt inne i kammaren utan överlappande eller form snedvridning som orsakas av trångboddhet.
    5. Fyll en skål med glas i botten med en diameter på 40 mm med mineralolja. Fördjupa droplet-fyllda rören i olja genom att trycka dem försiktigt ner med en bra pincett.
    6. Efter lastning alla prover, Använd ett glas en pipett för att ta bort all synlig smuts eller läcka droppar. Lägga till fler mineralolja om rören inte är eller inte kommer att vara helt nedsänkta i avbildningsprocessen.
    7. Genomföra avbildning av vattendroppar på ett epifluorescensmikroskop utrustad med motoriserad x-y steg (se Tabell för material). Använda ett 4 X air mål för alla imaging. För fluorescens imaging, använda en 130 W kort båge kvicksilverdunstlampa som fluorescens ljuskälla för belysning, och en god Jordbrukarsed filter (excitation 482/35 nm och utsläpp 514/LP nm) och en mCherry filtret inställt (excitation 562/40 nm och utsläpp 641/75 nm) för avbildning GFP-NLS och securin-mCherry signaler.
    8. Spela in time-lapse video i fältet ljusa och flera fluorescens kanaler var 6 till 9 minuter tills droppar förlorar sin verksamhet.

4. bild bearbetning och analys av Data

  1. Segmentering och spårning av droppar
    1. Importera inspelade data i formatet ”TIF” eller ”.oif” i bild analys programvara (se Tabell för material).
    2. Segmentera enstaka droppar med ljusa fält-kanal. Ljusa fält bilden visar droppar som ljusa cirklar med mörka gränser. Tillämpa tröskelvärde på bilden. Lägga till en spårning yta varje droppe av tuning tröskeln mellan mörka och ljusa pixlar så att varje yta täcker hela området av motsvarande droplet-programmet.
    3. Automatiskt spåra segmenten mellan intilliggande bildrutor med vektorautoregressiv motion algoritm. Tune acceptabel maximal resor distansera av en droppe mellan två intilliggande bildrutor att vara mindre än radien på de flesta droppar att exakt spåra små droppar.
    4. Kontrollera visuellt alla spår över hela videon att upptäcka Felaktiga segmenteringar segmentet det tomma utrymmet mellan droppar istället för faktiska droppar. Manuellt ta bort felaktiga spår.
    5. Segmentera och spåra bakgrundsområdet utan några droppar att få bakgrunden fluorescensintensiteten. För att förbättra signal-brus, subtrahera bakgrunden intensitet från fluorescensintensiteten hos droppar på varje tidsram.
    6. Exportera uppmätta parametrar för varje spår över tiden, inklusive det medelvärdet och standardavvikelsen för fluorescensintensiteten och droplet området till ”CSV” filer.
  2. Dataanalys av droplet storlek och svängning period
    1. Läsa in ”CSV-” filerna i R att skapa tomter fluorescensintensiteten över tiden för varje droppe. Spela in droplet-ID till en ”CSV”-fil.
    2. Importera filerna ”CSV” exporterade från programvaran analys och filen ”CSV” med en lista över droplet-ID till Matlab och Spara som ”.mat” filer för ytterligare dataanalys.
    3. Beräkna volymen av en komprimerad droplet utifrån den Exportera droplet området informationen efter segmentering och höjden av glas kammare19. Använda volymen för att beräkna radien av droplet som en sfär.
    4. Extrahera punkter av toppar och dalar med topp/botten upptäckt algoritm. Utföra manuella korrigeringar på placeringen av toppar och dalar att säkerställa de identifieras korrekt.
    5. För att beräkna perioden cellcykeln, beräkna intervalltiden mellan två intilliggande toppar. Ta ett genomsnitt av alla intervall för varje droppe som dess cellcykeln period.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I figur 2visar vi att detta protokoll ger mitotiska svängningar i både enkel, kärnkraft celler samt komplicerade celler med kärnor, där oscillatorn driver cykliska växlingen mellan atomkärnor bildandet och deformation. Atomkärnor-fri droppar generera mitotiska svängningar upp till 30 odämpad cykler över tidsrymden 92 timmar, som indikeras av periodiska syntes och nedbrytning av en fluorescens reporter securin-mCherry (figur 2A). Securin är ett substrat för Anaphasen främja komplexa APC/C. Nedbrytningen av securin-mCherry under Anaphasen anger således aktiviteten av APC/C.

För att undersöka den mitotiska oscillatorn förmåga att driva nedströms mitotiska händelser, levererat vi dessutom demembranated spermier kromatin, renad grönt fluorescerande protein-cellkärnelokalisering signal (GFP-NLS) och Hoechst 33342 färgämnen till den cytoplasmiska extrakt. Figur 2B visar autonoma växlingen av distinkta cellcykelns faser, interphase (blå staplar) och Mitos (röda staplar), under vilken ändringarna av nukleära morfologi drivs av självunderhållande mitotiska oscillatorn. Alla mitotiska händelser, dvs den kromosom decondensation och kondensation rapporterats av Hoechst 33342 (figur 2B, första raden), nukleära bildandet och kärn kuvert uppdelning av GFP-NLS (figur 2B, andra raden) och aktiviteten av cellcykeln oscillatorn av syntes och nedbrytning av securin-mCherry (figur 2B, tredje raden), sammanföll med varandra. Bilder samlades genom time-lapse Multi-Channel fluorescens Mikroskop. Våra experimentella resultat visar att rekonstruerade cellcykeln-systemet är kapabel att rekonstruera en mitotiska oscillator Cdk1 och APC/C, som kan köra en serie nedströms händelser inklusive kärn kuvert uppdelning och reformationen, och kromosom morfologi förändring.

Figur 3 visar de svängningar som anges av genomsnittlig fluorescensintensiteten hos securin-mCherry före och efter brus tas bort. Toppar och dalar blev mer uttalad efter borttagning av bakgrund buller, särskilt för de två första svängningar, som anger att brus tas bort kan bidra till att förbättra signal-brus för vidare analys.

Figure 1
Figur 1. Experimentell förfarande för att skapa droplet-baserade mitotiska celler. A. cytoplasmiska extrakt samlas in via ultra-centrifugering. B. extrakten levereras med flera komponenter för beredning och rapportering mitotiska svängningar. Med en vortexa metod blandas den extrakt och tensid olja för att generera droppar. C. droppar laddas in i en triklor (1 H, 1 H, 2 H, 2 H-perfluorooctyl) silan-belagd slang och sedan avbildas genom en epi-fluorescens Mikroskop. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2. Påvisande av cellcykeln dynamics använder fluorescerande reportrar. A. tidsförloppet för genomsnittlig securin-mCherry fluorescensintensiteten hos valda droplet-programmet, som anger 30 odämpade svängningar över en kurs 92 timmar. Infoga bilden visar fluorescens bilden med den valda droplet inramat av vit streckad cirkel. Skalstapeln är 100 µm. B. Tidsserien för ögonblicksbilder av en droppe i fluorescens kanaler (tre rader) och ljusa fält (den sista raden). Cyklisk progression av cellcykeln klockan och dess efterföljande mitotiska processer spåras samtidigt av flera fluorescerande reportrar. I Anaphasen substratet securin-mCherry indikerar aktivitet tillsynsmyndighetens klocka APC/C, Hoescht fläcken indikerar kromosomala morfologi förändringar och GFP-Lantmäteriverket indikerar kärn kuvert haverier och reformations. Nuclear kuvert (markerad med vita pilar) kan också påvisas i ljusa fält bilder, matchande localizationen av GFP-NLS anges atomkärnor. Skalstapeln är 50 µm. Interphase och mitotiska fas betecknas respektive blå barer och röda streck ovanför bilderna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3. Bakgrund subtraktion för genomsnittlig fluorescensintensiteten av securin-mCherry. A. svängning tid kursen innan bakgrund brus tas bort. B. svängning tid kursen efter brus tas bort. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi har lagt fram en roman metod för att utveckla en hög genomströmning konstgjorda cellsystem som möjliggör in vitro beredning och långsiktiga spårning av självunderhållande cell-cykel svängningar på enskild cell nivå. I området i närheten finns det flera kritiska steg som gör denna metod framgångsrika. Första, färskpressad Xenopus ägg med en god kvalitet, jämfört med lagda ägg, tenderar att producera extrakt med längre svängning aktivitet. Andra är inkapsling av extrakter inom de tensid-stabiliserad mikromiljö avgörande för att bevara aktiviteten svängning. Tredje, inkubation av olja droppar in en tunn slang ramarna droppar inom ett enda skikt, vilket gör det lättare för bildbehandling och långsiktig uppföljning. Det fjärde beläggning tube innervägg med triklor (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silan som ett anti lim till lägre ytan energi hjälper till att bevara aktiviteten extrakt. För det femte, tätning rören med olja skulle förhindra droplet flödet. Metoden olja-tätning kan också förhindra avdunstning och ytterligare bevara aktiviteten extrakt. Dessa förbättra tillsammans framgången av in vitro- rekonstruktion av robust svängningar i droppar och riktigheten av segmentering och spårning av dessa droppar i en långsiktig.

För att generera mikroemulsion droppar, har vi anställt både en enkel vortexa metod, liknar några andra studier29,30,31, liksom de vanliga mikrofluidik tekniker19, 20 (inga data anges). Båda metoderna kunde framgångsrikt generera mikroemulsioner på ett sätt som hög genomströmning. En begränsning är associerad med metoden vortexa är att droppstorlek inte enhetligt kontrolleras. För studier som kräver en väl definierad storlek med Minimerad storlek variation, kan mikrofluidik tekniker användas för bättre kontroll av droplet storlekar. Här har vi valt metoden vortexa över metoden mikroflödessystem av två skäl. Först, den har enkel och lätt att följa förfarandena, vilket skulle möjliggöra labs utan tillgång till mikroflödessystem tekniker eller närfältsmikroskop faciliteter att anpassa denna metod enkelt. Andra är metoden vortexa effektivare och mer ekonomiska för att utreda storlek beroende av beteenden av oscillatorn. Det kan skapa en bred fördelning av droplet storlekar med radier varierande från flera mikrometer upp till 300 mikrometer, medan mikroflödessystem tekniken kan bara generera en smala distribution centrerad på en fördefinierad storlek. Spänna av droplet storlekar genereras med den här metoden matchar det breda utbudet av cell storlekar som härrör från de karaktäristiska reduktiv celldelningarna i klyvning scenen av tidiga embryon som Xenopus och zebrafisk.

Denna metod har betydligt bättre hållbarhet av svängningar och genomströmning av analysera komplexa klocka dynamics, jämfört med befintliga metoder för beredning av biologiska oscillatorer i välblandade bulk lösning8, 32, som tenderar att producera snabbt dämpade svängningar. Vi har visat att denna metod har avsevärt förbättrat livslängden på svängningar från några cykler i bulk reaktion8 till över 30 cykler i närmiljön av droppar (figur 2A). Dessutom bulk reaktioner saknar likheten till faktiska cell dimensioner och kan inte sammanfatta den rumsliga organisationen uppnås genom funktionell uppdelning i riktiga celler. Att ha övervunnit dessa begränsningar av bulk reaktioner, ger vår konstgjorda cellen systemet en viktig plattform för att utreda utmanande frågor såsom cellulär heterogenitet och stochasticity av oscillatorer, som annars är omöjligt att utforska.

Metoden ger dessutom flexibilitet i grad av komplexitet som cellerna kan byggas. För att undvika eventuella störningar från komplicerade nukleära dynamiken, kan vi rekonstruera en minimal, endast cytoplasmiska cellcykeln-system som innehåller inga kärnor. Denna enkla och endast cytoplasmiska oscillator uppvisar självbärande svängningar betydligt bättre än vissa befintliga syntetiska oscillatorer. Genom att leverera sperma kromatin, kan vi också bereda mer komplexa celler med kärnor som växlar mellan självmontering på interphase och nukleära deformation på den mitotiska fasen på ett rytmiskt sätt. Aktiviteten av den mitotiska oscillatorn samt de efterföljande nukleära händelserna kan vara samtidiga mätt med flerkanaligt fluorescens imaging och encelliga spårning.

Metoden möjliggör också en hög grad av manipulation i droplet storlek och cellcykeln hastighet. Vortexa tekniken möjliggör generering av droppar med radier i ett brett spektrum, vilket kommer att gynna studiet av cell-storlek beroende av beteenden av cell cykler. Cellcykeln hastigheten kan dessutom anpassas genom att tillhandahålla olika koncentrationer av cyklin B1 mRNA33, som skulle göra det möjligt för oss att studera funktionen tunability av cellcykeln klockan.

Med dessa fördelar, kommer att in vitro- rekonstruerade cellcykeln plattformen, möjliggör visualisering, manipulation och analys av encelliga dynamics, sannolikt bana väg för nya insikter i de mer komplicerade stokastiska beteenden cellens cykel klocka. Metoden kan också vara generaliserbart till in vitro- studier av andra oscillatorer som traditionellt lita på bulk reaktioner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Vi har inget att redovisa.

Acknowledgments

Vi tackar Madeleine Lu för att konstruera securin-mCherry plasmid, varv Man Lee, Kenneth Ho och Allen P Liu för diskussioner om droplet generation, Jeremy B. Chang och James E. Ferrell Jr för att tillhandahålla GFP-NLS konstruera. Detta arbete stöds av National Science Foundation (tidiga karriär Grant nr 1553031), National Institutes of Health (MIRA #GM119688) och en Sloan Research Fellowship.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Xenopus laevis frogs Xenopus-I Inc.
QIAprep spin miniprep kit QIAGEN 27104
QIAquick PCR Purification Kit (250) QIAGEN 28106
mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit Ambion AM1340
BL21 (DE3)-T-1 competent cell Sigma-Aldrich B2935
Calcium ionophore Sigma-Aldrich A23187
Hoechst 33342 Sigma-Aldrich B2261 Toxic
Trichloro Sigma-Aldrich 448931 Toxic
(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl) silane
PFPE-PEG surfactant Ran Biotechnologies 008-FluoroSurfactant-2wtH-50G
GE Healthcare Glutathione Sepharose 4B beads Sigma-Aldrich GE17-0756-01
PD-10 column Sigma-Aldrich GE17-0851-01
VitroCom miniature hollow glass tubing VitroCom 5012
Olympus SZ61 Stereo Microscope Olympus
Olympus IX83 microscope Olympus
Olympus FV1200 confocal microscope Olympus
NanoDrop spectrophotometer Thermofisher ND-2000
0.4 mL Snap-Cap Microtubes E&K Scientific 485050-B
PureLink RNA Mini Kit ThermoFisher (Ambion) 12183018A
Fisherbrand Analog Vortex Mixer Fisher Scientific 2215365
Imaris Bitplane Version 7.3 Image analysis software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Murray, A. W. Cell cycle extracts. Methods in Cell Biology. 36, 581-605 (1991).
  2. Hannak, E., Heald, R. Investigating mitotic spindle assembly and function in vitro using Xenopus laevis egg extracts. Nature Protocols. 1, 2305-2314 (2006).
  3. Murray, A. W., Solomon, M. J., Kirschner, M. W. The role of cyclin synthesis and degradation in the control of maturation promoting factor activity. Nature. 339, 280-286 (1989).
  4. Yang, Q., Ferrell, J. E. The Cdk1-APC/C cell cycle oscillator circuit functions as a time-delayed, ultrasensitive switch. Nature Cell Biology. 15, 519-525 (2013).
  5. Chang, J. B., Ferrell, J. E. Jr Mitotic trigger waves and the spatial coordination of the Xenopus cell cycle. Nature. 500, 603-607 (2013).
  6. Trunnell, N. B., Poon, A. C., Kim, S. Y., Ferrell, J. E. Ultrasensitivity in the Regulation of Cdc25C by Cdk1. Molecular Cell. 41, 263-274 (2011).
  7. Kim, S. Y., Ferrell, J. E. Substrate competition as a source of ultrasensitivity in the inactivation of Wee1. Cell. 128, 1133-1145 (2007).
  8. Pomerening, J. R., Kim, S. Y., Ferrell, J. E. Systems-level dissection of the cell-cycle oscillator: bypassing positive feedback produces damped oscillations. Cell. 122, 565-578 (2005).
  9. Pomerening, J. R., Sontag, E. D., Ferrell, J. E. Building a cell cycle oscillator: hysteresis and bistability in the activation of Cdc2. Nature Cell Biology. 5, 346-351 (2003).
  10. Telley, I. A., Gaspar, I., Ephrussi, A., Surrey, T. Aster migration determines the length scale of nuclear separation in the Drosophila syncytial embryo. The Journal of Cell Biology. 197, 887-895 (2012).
  11. Telley, I. A., Gaspar, I., Ephrussi, A., Surrey, T. A single Drosophila embryo extract for the study of mitosis ex vivo. Nature Protocols. 8, 310-324 (2013).
  12. Tsai, T. Y. C., Theriot, J. A., Ferrell, J. E. Jr Changes in Oscillatory Dynamics in the Cell Cycle of Early Xenopus laevis Embryos. PLoS Biology. 12, e1001788 (2014).
  13. Chang, J. B., Ferrell, J. E. Jr Mitotic trigger waves and the spatial coordination of the Xenopus cell cycle. Nature. 500, 603-607 (2013).
  14. Yang, Q., Ferrell, J. E. Jr The Cdk1-APC/C cell cycle oscillator circuit functions as a time-delayed, ultrasensitive switch. Nature Cell Biology. 15, 519-525 (2013).
  15. Kumagai, A., Dunphy, W. G. Claspin, a novel protein required for the activation of Chk1 during a DNA replication checkpoint response in Xenopus egg extracts. Molecular Cell. 6, 839-849 (2000).
  16. Chen, R. H., Murray, A. Characterization of spindle assembly checkpoint in Xenopus egg extracts. Methods in Enzymology. 283, 572-584 (1997).
  17. Chen, R. H., Waters, J. C., Salmon, E. D., Murray, A. W. Association of spindle assembly checkpoint component XMAD2 with unattached kinetochores. Science. 274, 242-246 (1996).
  18. Minshull, J., Sun, H., Tonks, N. K., Murray, A. W. A MAP kinase-dependent spindle assembly checkpoint in Xenopus egg extracts. Cell. 79, 475-486 (1994).
  19. Good, M. C., Vahey, M. D., Skandarajah, A., Fletcher, D. A., Heald, R. Cytoplasmic Volume Modulates Spindle Size During Embryogenesis. Science. 342, 856-860 (2013).
  20. Hazel, J., et al. Changes in cytoplasmic volume are sufficient to drive spindle scaling. Science. 342, 853-856 (2013).
  21. Garibyan, L., Avashia, N. Research Techniques Made Simple: Polymerase Chain Reaction (PCR). The Journal of Investigative Dermatology. 133, e6 (2013).
  22. Hecker, K. H., Roux, K. H. High and low annealing temperatures increase both specificity and yield in touchdown and stepdown PCR. BioTechniques. 20, 478-485 (1996).
  23. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6, 343-345 (2009).
  24. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method. Journal of Visualized Experiments. 6, e253 (2007).
  25. Torreilles, S. L., McClure, D. E., Green, S. L. Evaluation and refinement of euthanasia methods for Xenopus laevis. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 48, 512-516 (2009).
  26. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Isolating Xenopus laevis Testes. Cold Spring Harbor Protocols. 2007, pdb.prot4735 (2007).
  27. Showell, C., Conlon, F. L. Egg Collection and In vitro Fertilization of the Western Clawed Frog Xenopus tropicalis. Cold Spring Harbor Protocols. 2009, (2009).
  28. Wilson, C. M. Methods in Enzymology. 91, Academic Press. 236-247 (1983).
  29. Schutze, T., et al. A streamlined protocol for emulsion polymerase chain reaction and subsequent purification. Analytical Biochemistry. 410, 155-157 (2011).
  30. Weitz, M., et al. Diversity in the dynamical behaviour of a compartmentalized programmable biochemical oscillator. Nature Chemistry. 6, 295-302 (2014).
  31. Ho, K. K., Lee, J. W., Durand, G., Majumder, S., Liu, A. P. Protein aggregation with poly(vinyl) alcohol surfactant reduces double emulsion-encapsulated mammalian cell-free expression. PloS One. 12, e0174689 (2017).
  32. Nakajima, M., et al. Reconstitution of circadian oscillation of cyanobacterial KaiC phosphorylation in vitro. Science. 308, 414-415 (2005).
  33. Guan, Y., et al. A robust and tunable mitotic oscillator in artificial cells. eLife. 7, (2018).

Tags

Biokemi fråga 139 mitotiska cell-cykel lidit själv svängningar Xenopus laevis Cykling cellfria extrakt time-lapse fluorescensmikroskopi in vitro- encelliga analys konstgjorda celler mikroemulsion
Beredning av cellcykeln svängningar i mikroemulsioner av cellfria <em>Xenopus</em> ägg extrakt
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Guan, Y., Wang, S., Jin, M., Xu, H., … More

Guan, Y., Wang, S., Jin, M., Xu, H., Yang, Q. Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts. J. Vis. Exp. (139), e58240, doi:10.3791/58240 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter