Immunology and Infection
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Antigena liposomer för generering av sjukdom-specifika antikroppar
Summary October 25th, 2018
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Beskrivs är utarbetandet av antigena liposomalt nanopartiklar och deras användning i stimulerande B-cells aktivering in vitro- och in-vivo. Konsekvent och robust antikroppssvar ledde till utvecklingen av en ny jordnötsallergi modell. Protokollet för att generera antigena liposomer kan utvidgas till olika antigener och immunisering modeller.
Transcript
Denna metod kan hjälpa till att besvara viktiga frågor inom immunologi, till exempel hur är vita blodkroppar aktiveras, och hur utvecklas allergier mot enskilda allergener? Den största fördelen med denna robusta och reproducerbara allergi musmodell är att färre möss kan användas för att ge en lägre varians med en experimentell population. Nya immunterapier för att kontrollera immunsvar kräver robusta musmodeller som ett första sätt att testa in vivo-effekt.
Således, konsekvenserna av denna teknik sträcker sig mot allergi immunterapi. Även om denna metod kan ge insikt i allergier, det kan också tillämpas på andra system, såsom autoimmunitet där oönskade antikroppssvar spelar en nyckelroll i sjukdomen. Generellt, individer nya till denna metod kommer att kämpa på grund av bristande erfarenhet av att arbeta med liposomala nanopartiklar eller en oerfarenhet med de tekniker som krävs i musen arbete.
Börja med att lägga till 2,5 molar motsvarande heterobifunktionella crosslinker till proteinet och placera reaktionen på en oscillerande shaker vid rumstemperatur i ungefär en timme. Efter en timmes inkubation med SPDP, avsalta proteinet på en kolumn ekvilovillig i 100-millimolar natriumacetat, och samla in fraktionerna. Bestäm 280-nanometerabsorbans, och poola de översta fraktionerna.
Tvätta kolonnen i PBS, och tillsätt 25-millimolar dithiothreitol, eller DTT, till poolade proteinfraktioner för en fem till 10-minuters inkubation. Mät sedan proteinens 280 och 343-nanometerabsorbanser för att möjliggöra beräkning av länkningsförhållandet baserat på proteinets molaritet och länkaren. Därefter kör de poolade fraktionerna av den PBS-tvättade kolumnen och samla in fraktionerna för mätning av 280-nanometern och toppfraktionspoolen som visas.
Tillsätt lämplig volym av 100x DSPE-PEG2000-Maleimide till proteinet för att uppnå en 1x, 10-faldig molaröverskottsförskottskoncentration med skonsam virvlande. Kör sedan reaktionen över natten under kväve i en förseglad rund bottenkolv. Följande dag, kör proteinet över en crosslinked dextran gel pärla pärla kolumn, och lagra den slutliga poolade fraktioner av lipid-linked protein vid fyra grader Celsius tills de används.
När den korrekta mängden av varje lipid har beräknats, kombinera alla lipider i en 12-milliliter borosilikat glas provrör, och använda en tre-milliliter spruta och slangar för att försiktigt blåsa kloroformen bort med kväve. Sedan, lyophilize lösningen med 100 mikroliter av DMSO över natten. Nästa morgon, tillsätt en milliliter lipid-länkade protein till 12-milliliter lipidrör, och sonikera lösningen tre till fyra gånger i 30 till 60 sekunder per ultraljudsbehandling i en ultraljudsbehandling vattenbad med minst fem minuters vilar mellan sonications.
Efter den sista ultraljudsbehandling, ladda provet i en av de extrudersprutor som placeras i extrudern, och placera extrudersprutan i den andra änden av extrudern. Den tomma sprutan kommer att fylla som lipiden är extruderad genom polykarbonat 0,8-mikrometer membran. Placera den färdigmonterade extrudern i ett värmeblock och tryck försiktigt ned kolven för att tömma sprutan.
Efter den sista extrudering, överför liposomer till en ren injektionsflaska, och extrudera lipider genom polykarbonat 0,2 och 0,1-mikrometer membran som just visat. Sedan, lagra liposomer på fyra grader Celsius. För att övervaka B-cells svar på antigena liposom aktivering, resuspend 1,5 gånger 10 till den sjunde splenocyterna i kalcium flux lastning buffert, och lägga till 1,5-mikromolar Indo-1 till cellerna, invertera lösningen i röret flera gånger för att blanda.
Efter en 30-minuters vattenbad inkubation vid 37 grader Celsius, skyddad från ljus, tillsätt fem gånger volymen av kalcium flux lastning buffert, och centrifug indo-1-märkta celler. För B-cellsgreating, fläckceller med anti-CD5 och anti-B220-antikropp i 0,5 milliliter lastningsbuffert vid fyra grader Celsius i 20 minuter, skyddade från ljus. Vid slutet av inkubationen, tvätta cellerna i färskt kalcium flux lastning buffert, och återanvända pelleten på en till två gånger 10 till den sjunde celler per milliliter av färskt kalcium flux kör buffert för lagring på is, skyddas från ljus fram till analys.
Därefter lägger du till 0,5 milliliter celler till ett tak, fem milliliter, rundbottens, polystyrenrör och värm cellerna till 37 grader Celsius i ett vattenbad. Efter tre till fem minuter, överför röret till en 37-graders Celsius vattenmantlat kammare ansluten till en recirkulerande vattenbad, och kör röret i vatten-jacka på flödet cytometer. Efter att ha samlat in 5, 000 till 10, 000 händelser per sekund, tillåta cellerna att stabiliseras i 15 till 30 sekunder, och initiera datainsamlingen, samla in data i minst 10 sekunder för att upprätta en bakgrundsläsning.
Vid 10-sekundersmärket, ta snabbt bort röret från flödescytometern, och tillsätt lämplig experimentell koncentration av antigena liposomer. Sedan, pulsvirvel cellerna, och läsa röret på cytometern i ytterligare tre till fem minuter. För att sensibilisera djuren, leverera 200 mikroliter av jordnötsextrakt som innehåller koleratoxin via sondmatning till varje fyra till fem veckor gamla BALB / c kvinnliga musmottagare en gång i veckan i tre veckor och 300 mikroliter av utspädd jordnöt extrakt i den fjärde veckan.
På dag 28, förbereda jordnöt extrakt till en slutlig koncentration av ett milligram per milliliter i PBS, och använda en rektal termometer för att mäta baslinjen kroppstemperaturen för varje sensibiliserat djur. När alla temperaturer har mätts, administrera 200 mikroliter jordnötsextrakt till varje mottagare via intraperitoneal injektion, och mäta kroppstemperaturen med rektalstermometern var 15 minuter i en timme efter injektion. Ett dopp i kroppstemperatur indikerar en allergi mot jordnötter.
Efter att ha isolerat splenocyter från de jordnötsallergiska mössen, använd en en milliliter insulinspruta utrustad med en 27-gauge, 5/8-tums nål för att intravenöst injicera 1,5 gånger 10 till den sjunde av de extraherade allergiska splenocyterna i svansvenerna hos naiva, utan stödda djur. En dag efter adoptivöverföring injicera intravenöst 200 mikroliter av Ara h 2 antigena liposomer i svansvenen hos varje BALB/c mus som fick de allergiska splenocyterna. Två veckor efter liposominjektionen, boosta mössen med en i.p.
injektion av lösliga Ara h 2, följt av en 200-microliter Ara h 2 utmaning på dag 61. Mät sedan kroppstemperaturen med rektalsonden var 15:e minut som den visas. Proteinkonjugering kan påvisas genom att köra en reducerande gel som visar en ökning av molekylvikten jämfört med det oskadade proteinet.
För att bedöma den antigena liposomsockperade B-cells kalciumfluset, grind de levande enstaka cellerna för att tillåta val av de B220-positiva CD5-negativa B-cellerna. Förhållandet mellan Indo-1 violett kontra Indo-1 blå fluorescens över tiden kan sedan analyseras för att bedöma mängden liposom-inducerad B-cells aktivering. Kvantifieringen av Ara h 2-specifika IgE och IgG1 i serumet hos jordnötsextrakt-sensibiliserade möss av ELISA indikerar att möss med förlänad känslighet som är boostade med Ara h 2 uppvisar mätbara Ara h 2-specifika IgE och IgG1 i deras serum.
Kroppstemperaturer som registrerats under Ara h 2-utmaningen visar att allergiska möss visar sänkta kroppstemperaturer efter utmaningen, medan kroppstemperaturen hos naiva möss förblir konsekventa. Samtidigt försöker detta förfarande, Det är viktigt att komma ihåg att noggrant hålla reda på mängden lipid-linked protein införlivas i liposomer, som för mycket protein kan göra extrudering svårt. Efter detta förfarande, andra metoder som spårning och sortering av allergen-specifika B och T-celler kan utföras för att svara på ytterligare frågor om hur dessa allergen-specifika celler svarar på terapier.
Denna teknik kommer att bana väg för forskare inom allergiområdet att utforska nya immunterapier som bekämpar allergiska sjukdomar med hjälp av denna musmodell. Glöm inte att det kan vara farligt att arbeta med koleratoxin och att riktlinjerna för dess användning bör följas enligt dina lokala institutionella biologiska säkerhetsstandarder.
Please enter your institutional email to check if you have access to this content
has access to
BackLogin to access JoVE
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
To receive a free trial, please fill out the form below.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You
Thank You
Thank You
CH
DE