Mätning Naturligt förvärvade Phagocytosis-inducerande antikroppar mot Plasmodium falciparum parasiter av en Flow Cytometry-baserade assay

Detta protokoll gör det möjligt att mäta förmåga antikroppar att opsonize och inducera fagocytos av plasmodium falciparum infekterade erytrocyter. Antikroppar som finns i serum av individer som utsätts naturligt för parasitinfektion, liksom de som framkallas genom immunisering med parasitantigener, kan testas. Demonstrerar proceduren med mig blir Maiken Visti, en tekniker från mitt laboratorium.

För att ställa in en THP-1 cell kultur för en fagocytos analys, dagen före experimentet utsäde cellerna i en 25-centimeters kvadratodling kolv och en koncentration av 2,5 gånger 10 till den femte celler per milliliter i THP en cell odling medium. På dagen för experimentet, minst en timme före experimentblocket till runda-botten 96-brunnsplattor med 150 mikroliter av sterila 2%FBS i PBS per brunn. För mitten till sent stadium trophozoite-infekterade erytrocyter skörd och rening, förbereda cirka 1,2 milliliter av packade P falciparum parasit kultur i 10 milliliter av parasit kultur medium, med minst 5%parasitemia och lägga till en magnetisk kolumn.

Tvätta kolonnen med 50 milliliter av parasitkulturmedium. För att elera de infekterade erytrocyterna, ta bort kolonnen från magneten och spola den med 50 milliliter av parasitkulturmedium. Samla sedan de infekterade erytrocyterna genom centrifugering och resuspend pelleten i en milliliter av färskt parasitkulturmedium för räkning.

Justera den renade infekterade erytrocytupphängningen med 3,3 gånger 10 till de sjunde cellerna per milliliter i parasitodlingsmedium som innehåller ethidiumbromid, till en slutkoncentration på 2,5 mikrogram per milliliter. Därefter tar du bort blockerande lösning från en 96-brunnsplatta genom att snärta fast plattan i en avfallsbehållare. Ta sedan bort eventuellt överskott över en pappershandduk och tillsätt 30 mikroliter av ethidiumbromid etiketten infekterade erytrocyt suspension till alla utom en brunn i den övre halvan av plattan.

Tillsätt 30 mikroliter av parasitkulturmedium till den tomma brunnen, och inkubera plattan i 10 minuter vid rumstemperatur, skyddad från ljus. I slutet av inkubationen, tillsätt 170 mikroliter av parasitkulturmedium till varje brunn och sediment de infekterade erytrocyter längst ner på plattan genom centrifugeringen. Ta bort supernatanten genom att snärta in plattan i en avfallsbehållare och tvätta de ethidiumbromidmärkta infekterade erytrocyterna ytterligare två gånger, med 200 mikroliter av parasitkulturmedium per brunn, som precis visats.

Efter den andra tvätten, använd en flerkanalspipett för att försiktigt ta bort hela volymen av supernatant från varje brunn, utan att störa pelletsen. Och resuspend ethidium bromid-märkt infekterade erytrocyter i 30 mikroliter av antikroppslösning, inklusive lämpliga kontroller och testprover som tidigare utarbetats i parasit kultur medium. Placera sedan plattan vid 37 grader Celsius i 45 minuter, skyddad från ljus.

Medan de infekterade erytrocyter håller på att opsonized, samla THP-1 celler genom centrifugeringen, och återanvända pelleten i 12 milliliter av färska, förvuppvade THP-1 cell kultur medium. Efter en andra centrifugering, resuspend pelleten i en milliliter av THP-1 cell odling medium för räkning, och justera cellkoncentrationen till fem gånger 10 till den femte celler per milliliter i THP-1 cell odling medium. Ta bort blockeringslösningen från den andra 96-brunnsplattan och tillsätt 100 mikroliter THP-1-celler till varje brunn.

Placera sedan plattan i cellkulturinkubatorn. I slutet av opsonisering inkubation, tillsätt 170 mikroliter av parasitkultur medium till varje brunn av opsonization plattan, och sediment de infekterade erytrocyter till botten av plattan genom centrifugeringen. Tvätta opsonized infekterade erytrocyter två gånger med 200 mikroliter av parasitkulturens medium per brunn, med hjälp av en flerkanalspipett för att försiktigt ta bort supernatanten efter den andra tvätten.

Resuspend den opsonized infekterade erytrocyter i 100 microliters av förvuppvade THP-1 cell kultur medium per brunn, och överföra 50 microliters av varje opsonized infekterade erytrocyt suspension till en motsvarande väl i fagocytosis plattan. När alla celler har tillsatts, placera plattan i cellodlingen inkubatorn i högst 40 minuter, skyddad från ljus. Vid slutet av inkubationen, stoppa fagocytosen genom centrifugering vid fyra grader Celsius.

Ta bort supernatanten och resuspend pelletsen med 150 mikroliter av rumstemperatur ammoniumkloridlysningslösning per brunn. Efter exakt tre minuter, tillsätt 100 mikroliter iskall vid 2%FBS i PBS för att stoppa lysen, och sediment de intakta cellerna genom centrifugeringen. Därefter tvätta cellerna tre gånger med 200 mikroliter av färsk iskall 2%FBS i PBS per brunn, per tvätt.

Efter den slutliga tvätten, resuspend cell pelleten i 200 mikroliter av färsk iskall 2%FBS i PBS per brunn. För flödescytometri förvärv och analys, omedelbart ladda cellerna på ett flöde cytometer och använda den linjära framåt kontra linjära sidan scatter tomt för brunnarna utan infekterade erytrocyter att gate THP-1 celler. Förvärva 10, 000 händelser i denna gate, och använda THP-1 cellerna med de infekterade erytrocyter opsonized med en positiv kontroll för att inrätta en histogram tomt att mäta ethidium bromid fluorescens intensitet.

För analys, öppna den linjära framåt kontra linjära sidan scatter tomt för brunnarna utan infekterade erytrocyter, och gate THP-1 celler. Ställ sedan in en positiv grind i ett FL-3-histogram och kopiera dessa portar på alla de andra provväldarna för att bestämma andelen ethidiumbromid-positiva THP-1-celler. För varje prov som testas kan fagocytos rapporteras som absolutvärde eller som den relativa fagocytos som beräknas som en procentsats med den positiva kontrollen som maximum.

THP-1-cellerna bör kontrolleras med jämna mellanrum för FC gamma receptor yta uttryck genom flöde cytometri. Cellerna ska vara negativa för CD16, och positiva för CD32 och CD64. I detta opsonization experiment, var THP-1 cellerna gated först enligt deras framåt och sida scatter profiler, att tillåta kvantifiering av andelen ethidium bromid-märkta celler, vägledande för celler som har fagocytized minst en antikropp opsonized infekterade erytrocyt.

De negativa kontrollproverna bör alla generera en enda negativ topp i FL3-kanalen, med få händelser som observerats i ethidiumbromidmarkören. Följaktligen bör medelvärdet av fagocytosvärdena, både som absoluta ethidiumbromid-positiva THP- 1-celler och som relativa fagocytosprocent, vara mycket låga. Den positiva kontrollen bör däremot generera spår med två toppar, en negativ topp och en klart positiv och välseparerad topp som ligger inom ethidiumbromidmarkören.

Medelvärdet av fagocytosvärdena är normalt högst för den positiva kontrollen, följt av den malariaexponerade kvinnliga poolen och de enda malariaexponerade kvinnokontrollerna. Även om denna metod ger ett konsekvent resultat har avvikelser i de justerade linjernas lutningskoefficient observerats. Därför rekommenderas användning av relativa värden, särskilt om det inte är möjligt att köra alla prover i ett enda experiment.

Var noga med att noggrant planera experimentet i förväg, förbereda både THP-1-cellerna och parasiterna därefter, med endast trofoocyter med en renhet som är större än 80%Dessutom, se till att alltid inkludera lämpliga kontroller, för att möjliggöra kvaliteten på experimentet som skall bedömas och underlätta dataanalys.